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本文分為上下2篇此篇文章為下篇文章您可以在頁(yè)尾點(diǎn)擊查看上段文章。 二、高效逆流色譜法的研究進(jìn)展：溶劑系統(tǒng)的選擇對(duì)于HSCCC分離十分關(guān)鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統(tǒng)的選擇還沒(méi)有充分的理論依據(jù)，而是根據(jù)實(shí)際積累的豐富經(jīng)驗(yàn)來(lái)選擇。根據(jù)溶劑系統(tǒng)的極性，可以分為弱極性、中等極性和強(qiáng)極性三類。經(jīng)典的溶劑系統(tǒng)有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙醋-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等11。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，總結(jié)分析并參照相關(guān)的專著及文獻(xiàn)，從所需分離的物質(zhì)的類別出發(fā)去尋找相似的分離實(shí)例，選擇極性適合的溶劑系統(tǒng)，調(diào)節(jié)各種溶劑的相對(duì)比例，測(cè)定目標(biāo)組分的分配系數(shù)，最終選擇合適的溶劑系統(tǒng)12。
本次實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物是蘆薈苷，為中等級(jí)性化合物，這類化合物在乙酸乙酯和氯仿中有一定的溶解性,根據(jù)兩相溶劑系統(tǒng)選擇原則，可以選擇以乙酸乙酯或氯仿為有機(jī)相主體的溶劑系統(tǒng),適用溶劑體系為乙酸乙酯-甲醇-水或氯仿-甲醇-水。在乙酸乙酯-甲醇-水體系中,隨著甲醇比例的增大，蘆薈苷類化合物在水中的溶解性增強(qiáng),因而分配系數(shù)變小。在氯仿-甲醇-水體系中,隨著甲醇比例的增大,蘆薈苷類化合物在有機(jī)相中的溶解性增強(qiáng),由于氯仿的密度比水大,水在上相而氯仿在下相,因而分配系數(shù)也是變小。根據(jù)貴曉霞13等人在HSCCC分離天然產(chǎn)物中苷類化合物中的最新研究，在苷類化合物的分離中,主要用了三類溶劑體系,即正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水,醋酸乙酯(氯仿)-甲醇(乙醇)-水,醋酸乙酯-正丁醇-水。
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水此類體系主要分離極性較小的單糖苷類,可根據(jù)化合物極性差別調(diào)整不同比例的甲醇、醋酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)體系的極性,達(dá)到分離目的。常用的溶劑體系有:正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水(6∶3∶2∶5),正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)
醋酸乙酯(氯仿)-甲醇-水此類體系主要分離單糖苷,雙糖苷類。由于氯仿毒性大,不利于環(huán)保,醋酸乙酯使用的越來(lái)越多?？筛鶕?jù)需要在上下相中加入不同體積比的甲醇、乙醇、醋酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)體系的極性,常用的體系有醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)。
醋酸乙酯-正丁醇-水該體系用于分離極性較大的雙糖苷類。一般通過(guò)調(diào)整正丁醇比例來(lái)分離不同極性物質(zhì)。若目標(biāo)組分易溶于該體系上相,加入乙醚可將組分拉向下相,反之,則加入三乙基乙胺鹽較合適。常用溶劑體系有醋酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3)
陳存社14等采用幾種溶劑系統(tǒng)做對(duì)照,從南非進(jìn)口的開普蘆薈凝膠粉末中分離蘆薈有效成分,實(shí)驗(yàn)表明∶采用氯仿-甲醇-丙酮-水（9∶8∶1∶8）為溶劑系統(tǒng),分離出蘆薈大黃素苷、蘆薈大黃素,效果最佳。袁黎明等利用氯仿-甲醇-水（4∶3.8∶2）的溶劑分離系統(tǒng),亦能對(duì)蘆薈中的蒽醌類植物成分進(jìn)行有效的分離,分離后得到12個(gè)分離效果較好的色譜峰。而王春燕15等采用氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）,從蘆薈生藥中一次性分離得到蘆薈甙(純度99.99%)和蘆薈大黃素(純度95.83%),分別達(dá)到定量和鑒別用化學(xué)對(duì)照品要求。但上一屆師姐祁潔珍參考陳存社、袁黎明、王春燕等人的文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均得不到理想的分離效果，原因可能是：一、在配置過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)體系很容易乳化，經(jīng)過(guò)靜置等方法也不能消除，造成在分離過(guò)程中基線不穩(wěn)，而且峰形不漂亮，還沒(méi)掌握消除乳化現(xiàn)象的方法；二、科研過(guò)程中有錯(cuò)，缺乏誠(chéng)信。
祁潔珍師姐用薄層色譜法和高效液相色譜法測(cè)定了蘆薈有效成分樣品在分離用溶劑系統(tǒng)的K值,確定最佳分離體系為（１）：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）和（２）：乙酸乙酯-甲醇-水（5：1.2：5），應(yīng)用高速逆流色譜法將蘆薈樣品一次性分離得到蒽醌類有效成分,再用高效液相色譜法檢測(cè)分離成分的純度。用溶劑體系（１）進(jìn)行高速逆流色譜法分離得到兩組蒽酯類成分,第一組分含有一未知醌類化合物,第二組成分含有蘆薈苷和蘆薈大黃素成分,經(jīng)高效液相色譜法定量分析得,未知物的純度達(dá)90%，蘆薈苷和蘆薈大黃素的純度都沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果，用溶劑體系（２）進(jìn)行高速逆流色譜分離，但是分離結(jié)果沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果。用（１）溶劑體系可使蘆薈中的蒽醌類化合物得到有效的分離，但是所分得的蘆薈苷和蘆薈大黃素的純度較低，在以后的實(shí)驗(yàn)中，可將分得的兩組成分再用另外的溶劑體系二次分離，可望得到高純度的蘆薈苷與蘆薈大黃素單體，分別達(dá)到定量和鑒別用化學(xué)對(duì)照品的要求。三、初步實(shí)驗(yàn)方案：本實(shí)驗(yàn)擬探究用HSCCC分離蘆薈苷單體的最佳溶劑系統(tǒng)，在用HSCCC之前將先用其他方法進(jìn)行分離，比較各種方法的分離效果及優(yōu)劣勢(shì)HSCCC方案簡(jiǎn)略如下：
?。ㄒ唬⒋_定樣品中含有蘆薈苷成分TLC定性檢測(cè)：自行制備硅膠薄板常規(guī)點(diǎn)樣1~20μL（樣品與標(biāo)準(zhǔn)品平行），展開劑為乙酸乙酯：甲醇：水=25：4：3（體積比），若比移值太小，可適當(dāng)增加大極性溶劑的比例；若比移值太高，可適當(dāng)降低大極性溶劑的比例.按常規(guī)展開，取出薄層板，放平晾干后噴氫氧化鉀-甲醇溶液顯色（蒽醌苷在堿性條件下的顯色反應(yīng)），對(duì)比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值，確定蘆薈苷存在與否。HPLC定量檢測(cè)：(外標(biāo)法)
精密稱（量）取對(duì)照品和供試品，分別制成對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積（或峰高），計(jì)算含量。色譜條件可參照色譜柱;流動(dòng)相:30%-60%甲醇水溶液線性洗脫25min；柱溫：室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)：365nm（254）
?。ǘ⒚魅軇┫到y(tǒng)條件
1、先根據(jù)一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行試實(shí)驗(yàn)：1)參考貴曉霞的溶劑系統(tǒng)：醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)、王春燕：氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）、祈潔珍：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）進(jìn)行條件的探索，以考察分層情況，包括分層時(shí)間，上下兩相的體積比、有無(wú)乳化現(xiàn)象等，并用HPLC測(cè)定各系統(tǒng)的分配系數(shù)：樣品溶于一定體積的溶劑系統(tǒng)中，各取等
體積的上相、下相，風(fēng)干后溶于等體積的單一溶劑，測(cè)定上相的色譜峰面積A1，下相的色譜峰面積A2，Ka=A1/A2。一般K值在0.5～2之間樣品可以得到有效的分離?；蛴肨LC法：樣品在等體積上下相中分配達(dá)到平衡后,TLC展開,通過(guò)斑點(diǎn)大小或顏色深淺來(lái)判斷各組分在兩相間的分布狀況。
2)選取上述各個(gè)溶劑體系，用高速逆流色譜儀分離蘆薈甲醇浸膏，色譜條件如下：以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動(dòng)相；以8ml/min的恒流速將上相泵入作為固定相，以2ml/min的恒流速將下相泵入，螺旋管轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速800r/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。記錄分離結(jié)果并分析3)HSCCC分離條件（溶劑系統(tǒng)）的優(yōu)化
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整溶劑體系的選擇：溶劑體系是HSCCC分離的關(guān)鍵。好的溶劑體系需滿足以下條件：(I)溶劑系統(tǒng)不會(huì)造成樣品的分解或變性。(ii)溶劑系統(tǒng)不會(huì)干擾樣品的檢測(cè)。(iii)各個(gè)組分在其兩相的分配系數(shù)在0.5~2之間，且有一定的差值，并且各組分的分配系數(shù)值要有足夠的差異，分離因子最好大于或等于1.5;(iv)溶劑系統(tǒng)的分相時(shí)間不超過(guò)30秒。上下兩相體積比合適，以免浪費(fèi)溶劑;(v)盡量采用沸點(diǎn)低的溶劑，以方便后續(xù)處理。(vi)盡量避免使用毒性大的溶劑。然后配制各種不同的兩相溶劑體系，看其分相時(shí)間是否在30s之內(nèi)，如果在30s之內(nèi)分相，加入適量的樣品，利用HPLC依次測(cè)定各組分在每個(gè)溶劑體系中上相和下相的濃度，并計(jì)算其分配系數(shù)。同時(shí)還要考慮是否能有效地分離蘆薈的有效成分，直到選出合適的體系。將上述選定的溶劑體系配制、分相、脫氣后應(yīng)用于HSCCC，并對(duì)其轉(zhuǎn)速、流速、分離溫度、固定相比例和洗脫梯度等條件進(jìn)行優(yōu)化，選出最優(yōu)的HSCCC分離條件。
?、俾菪苻D(zhuǎn)速的選擇：螺旋管柱的旋轉(zhuǎn)速度對(duì)兩相的混合程度具有決定性的影響作用，同時(shí)它產(chǎn)生的離心力場(chǎng)對(duì)固定相的保留也具有決定性的影響。高界面張力的溶劑系統(tǒng)：使用較高的轉(zhuǎn)速，以使兩相之間有劇烈的混合而促進(jìn)分配和減少質(zhì)點(diǎn)傳遞的阻力。低界面張力的溶劑系統(tǒng)：使用較低的轉(zhuǎn)速，避免過(guò)分的混合作用引起樣品區(qū)帶沿螺旋管長(zhǎng)度的展寬和乳化作用帶來(lái)的固定相流失。②流速的影響：流動(dòng)相流速也會(huì)影響兩相的分布，一般情況下，流動(dòng)相流速越大，固定相流失加重，但流速過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從而造成對(duì)溶劑的浪費(fèi)。③溫度的影響：溫度的提高溶劑的砧度有很大的影響，一般提高溫度會(huì)獲得高的保留值，而相反降低溫度則得到低的保留值，但一般溫度不可能提高太多，因?yàn)樗玫亩际怯袡C(jī)溶劑，沸點(diǎn)很低。
還有一種方法粗制 將風(fēng)干后的蘆薈粉末，加氯仿回流充分提取2小時(shí)，振搖，趁熱過(guò)濾，除去苷元及其他游離蒽醌衍生物，殘?jiān)诒砻婷箫L(fēng)干，以除去剩余的氯仿。將殘?jiān)糜谒魇教崛∑髌渲?，?5％乙醇水浴回流加熱提取4小時(shí)，趁熱過(guò)濾，濾紙用95％乙醇反復(fù)洗滌3次，棄去濾渣，向?yàn)V液中緩慢加入5％氫氧化鉀溶液，玻璃棒攪拌，同時(shí)以PH試紙調(diào)至9～10，靜置30分鐘后過(guò)濾，沉淀以95％乙醇洗滌3次，合并洗液，置真空干燥箱中，以0.8Mpa，60～70℃，減壓濃縮至干，此沉淀即為總蒽醌苷的鉀鹽。沉淀加入95％乙醇，使沉淀懸浮于乙醇中，緩慢加入冰醋酸，調(diào)至PH值中性，水浴加熱，趁熱抽濾，濾液濃縮，濃縮液加醋酸鉛液，均勻振搖，待沉淀不再繼續(xù)出現(xiàn)，過(guò)濾，沉淀以蒸餾水沖洗3次。將沉淀置水中，以HS脫鉛，過(guò)濾，濾液用1％氫氧化鈉調(diào)PH值至中性，以iso-proH重結(jié)晶，冰浴過(guò)濾，所得晶體為粗制蘆薈苷。
精制 將所得晶體溶解于70％甲醇中，溶液上Sephadex LH-20凝膠柱層析，以70％甲醇不斷沖洗，分段收集。所洗脫依次得到：蘆薈大黃素雙葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、蘆薈苷。后段收集淡黃色結(jié)晶，減壓濃縮至干，即得到精制蘆薈苷結(jié)晶。上一頁(yè)：植物中的蘆薈苷的提取活性成分的常用方法
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