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		氣相色譜分析確證轉(zhuǎn)基因植株具有合成PHB能力

　　自然界中多種細(xì)菌的碳源及能源貯藏物這種聚酯的物理化學(xué)特性與激進塑料相似，聚三羥基丁酸酯（PHB;種子特異性啟動子;葉綠體基因工程;煙草;油菜及其它類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì)。并具有生物可降解性，如能取代化學(xué)合成塑料將減少環(huán)境中的塑料廢棄物，從源頭治理“紅色污染”問題。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的PHB價格過高，無法在市場上與化學(xué)合成塑料競爭。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸將視線轉(zhuǎn)向植物生物反應(yīng)器。轉(zhuǎn)基因植物能夠利用二氧化碳為碳源、太陽能為能源合成目的產(chǎn)物，大大降低生產(chǎn)本錢，為生產(chǎn)具有市場競爭力的新型生物可降解塑料提供可行途徑。此領(lǐng)域雖然已取得一定進展，但遠(yuǎn)未達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平。大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)要求轉(zhuǎn)基因植物能夠在確保環(huán)境平安性的前提下高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)PHB本文嘗試改善植物中PHB生產(chǎn)體系，為環(huán)保型塑料早日進入市場作出努力。由于表達(dá)框架中多次使用同一啟動子會導(dǎo)致基因緘默，本文克隆了另一種子特異性啟動子nap300以替換重復(fù)使用的7S啟動子，減輕“共抑制”將nap300與GUS基因相連進行功能鑒定。

　　熒光檢測和組織化學(xué)染色的結(jié)果都證明此僅300bpDNA 序列足以調(diào)控基因進行種子特異性表達(dá)。盡管B盒作為高度激進區(qū)在種子特異性表達(dá)中起重要作用，位于此處的兩個堿基替代型突變并未使nap300活性明顯降低，對啟動子的時空表達(dá)模式也無明顯影響。將nap3007S分別與phbA 基因(編碼 3-酮硫裂解酶)相連，相似表達(dá)環(huán)境中對二者功能進行比擬，發(fā)現(xiàn)兩個啟動子表達(dá)模式基本相同并在同一時期達(dá)到活性高峰，因此nap300可用于改善PHB合成基因在植物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控。通過對種子特異性啟動子的比較可加深對其表達(dá)模式的解，為植物基因工程中的精細(xì)調(diào)控提供依據(jù)。葉綠體基因工程是隨著植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展剛剛興起的生物技術(shù)，具有超量表達(dá)外源基因，為原核基因提供適宜表達(dá)環(huán)境，消除“位置效應(yīng)”和基因沉默，環(huán)境平安性好等優(yōu)點，較更適合用于植物生物反應(yīng)器方面的研究。本研究在國內(nèi)率先探討將葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)引入植物生產(chǎn)生物可降解塑料這一領(lǐng)域的可行性(國外僅有日本一例)構(gòu)建了葉綠體轉(zhuǎn)化及表達(dá)載體pPV-PHB通過基因槍法將PHB合成相關(guān)基因?qū)霟煵萑~綠體基因組。轉(zhuǎn)基因煙草順利達(dá)到同質(zhì)化，其形態(tài)和生長發(fā)育均無異常。Northern點雜交檢測標(biāo)明與PHB合成相關(guān)的三個基因均能在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，未出現(xiàn)核轉(zhuǎn)化中經(jīng)常發(fā)生的基因緘默”現(xiàn)象。通過RT-PCR進一步檢測標(biāo)明葉綠體型轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因的表達(dá)水平明顯比核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因的表達(dá)水平高。氣相色譜分析確證轉(zhuǎn)基因植株具有合成PHB能力。

　　這些都標(biāo)明葉綠體轉(zhuǎn)化適合用于轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)PHB中文摘要的研究。雖然葉綠體型轉(zhuǎn)基因煙草中產(chǎn)物含量偏低，并未達(dá)到預(yù)期結(jié)果，但經(jīng)進一步改進與完善，終將會勝利地用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的植物基因工程中。為初步探討葉綠體轉(zhuǎn)化中在同源重組反應(yīng)介導(dǎo)下整合外源基因的機理，從油菜葉綠體基因組中分離兩段序列作為同源片段，基因槍法轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果顯示即使供體所含同源片段與受體葉綠體基因組相應(yīng)區(qū)域差異高達(dá) 10％，轉(zhuǎn)化效率也無降低。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)有助于促進“通用載體”改進，擴展葉綠體轉(zhuǎn)化受體范圍乃至達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用水平。勝利地通過H次轉(zhuǎn)化獲得整合并表達(dá)多基因的轉(zhuǎn)基因煙草，縮短了研究周期，對相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物的研究有一定參考價值。本文還優(yōu)化了油菜轉(zhuǎn)化體系，使轉(zhuǎn)基因油菜同時整合三個 PHB合成相關(guān)基因的效率由 7．69O增加至 16．00田間試驗與產(chǎn)物分析正在進行中。

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