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| 探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素 | |||||||||||
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| 研究系統(tǒng)地探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素。將廣譜抗稻瘟病基因Pi9轉(zhuǎn)入8個秈稻品種(豐源B湘晚秈11號，建立了穩(wěn)定、高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻的轉(zhuǎn)化體系。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。湘晚秈13號，R996527170125H00325H075和粳稻品種日本晴的愈傷組織中，得到轉(zhuǎn)Pi9基因的株系，并對T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株進行了GUSPCR和RT-PCR檢測以及T2代植株的稻瘟病抗性鑒定。同時，對3個野生稻中的Pi29位點進行了進化分析。本研究主要結(jié)果如下： pc1301-Pi9質(zhì)粒的鑒定 將大腸桿菌和農(nóng)桿菌中提取的質(zhì)粒pc1301-Pi9分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和KpnⅠ酶切，電泳分析標(biāo)明質(zhì)粒pc1301-Pi9可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穩(wěn)定遺傳。 2高效轉(zhuǎn)化體系的建立和Pi9基因?qū)Χi稻的轉(zhuǎn)化研究不同培養(yǎng)基對秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將8個秈稻品種的幼稚種子分別接種子NBN6MSCC和L3培養(yǎng)基上，結(jié)果標(biāo)明，NBN6MSCC和L3這5種培養(yǎng)基誘導(dǎo)秈稻的平均出愈率分別為：81.7％、75.4％、68.0％、58.5％和55.5％。因此，NB培養(yǎng)基最適于誘導(dǎo)秈稻胚性愈傷組織 ABA 對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 A BA 對某些品種愈傷組織的誘導(dǎo)具改善作用，可減少褐化死亡現(xiàn)愈傷組織的繼代分析 比較了L3和NB兩種培養(yǎng)基對愈傷組織繼代效果，發(fā)現(xiàn)L3更適于愈傷組織繼代。愈傷組織繼代8d15d25d分析標(biāo)明，愈傷組織宜選擇繼代15d左右做共培養(yǎng)較好，這時愈傷組織大而嫩黃且生命力強。共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響 以1701為受體，共培養(yǎng)時間為1d2d3d4d獲得的抗性愈傷率分別為32.6％、68.2％、75.5％和60.0％。因此，共培養(yǎng)時間為3d轉(zhuǎn)化效果最好，獲得的抗性愈傷率最高，達75.5％。不同菌液濃度對愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響 用OD值為0.51.01.52.0菌液濃度與1701愈傷組織進行共培養(yǎng)，獲得的抗性愈傷率分別為64.1％、74.7％、62.1％和51.0％。因此，OD值為1.0菌液濃度更適于秈稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化。乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響 共培養(yǎng)中加入200μmolL乙酰丁香酮可獲得的較高的抗性愈傷率，為75.3％。菌液、共培養(yǎng)培養(yǎng)基以及同時在菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮，獲得1701抗性愈傷率分別為59.8％、68.3％和75.7％。標(biāo)明菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基同時加入乙酰丁香酮，轉(zhuǎn)化效果較好。篩選壓力的確定 40mgL潮霉素B濃度適用于秈稻抗性愈傷組織的篩選；20mgL潮霉素B濃度用于生根培養(yǎng)基中幼苗的篩選抗性愈傷組織的篩選情況 愈傷組織經(jīng)S_40培養(yǎng)基篩選后，日本晴的抗性愈傷率達89.9％。秈稻的抗性愈傷率在69.4％～82.5％之間，其中R996為69.4％，25H003為82.5％。9個品種的轉(zhuǎn)化情況 本研究日本晴的轉(zhuǎn)化率是63.3％，秈稻品種陽性苗的轉(zhuǎn)化率在3.2％～25.9％之間，其中25H075最低為3.2％，R996最高達25.9％。 10不同激素配比對愈傷組織分化率的影響 6-BA 2mgL+KT2mgL+NA A0.5mgL+IA A0.5mgL激素配比適于抗性愈傷組織的分化。GUSPCR和RT-PCR檢測及稻瘟病抗性鑒定 對獲得的T1代和T2代植株經(jīng)GUSPCR和RT-PCR檢測以及T2代植株的稻瘟病抗性鑒定，標(biāo)明Pi9基因已整合到受體基因組中，并遺傳給子代，子代中穩(wěn)定表達。 4Pi29位點的進化分析 對3個野生稻中的Pi29位點NBS-LRR基因與Pi2和Pi9位點NBS-LRR基因進行序列比較分析，標(biāo)明除假基因外的所有這些NBS-LRR基因?qū)儆谙嗤倪M化樹，有共同的祖先，并且大多數(shù)NBS-LRR基因都有一個高度保守的內(nèi)含子。這一研究為稻瘟病抗性基因的進化分析奠定了基礎(chǔ)，并為植物中廣譜抗性分子機理的說明提供了線索。 |
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