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		液相-示差/蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用法

　　液相-示差/蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用法PEG分子在280nm下并無特征紫外吸收，而活化后的PEG分子，由于活性基團(tuán)的引入，可能存在214nm下的紫外吸收。因此，為了檢出以各種形式存在的PEG，應(yīng)采用通用型檢測器，并結(jié)合凝膠或反相等高效液相色譜對(duì)修飾前后的rhGH及游離的PEG進(jìn)行分離。由于示差檢測器的靈敏度較低，同時(shí)只能使用恒梯度流動(dòng)相，因此，不適于檢出痕量的游離PEG。而蒸發(fā)光檢測器在上述方面有較大優(yōu)勢。首先通過優(yōu)化色譜條件，將PEG-rhGH、rhGH與游離PEG有效分離后，再將PEG從修飾后的rhGH上水解下來；通過計(jì)算水解后PEG減去游離PEG的量，再除以PEG的分子量得到偶聯(lián)到rhGH上的PEG的摩爾數(shù)，進(jìn)而通過紫外檢測器求得rhGH的摩爾數(shù)，兩者之比再除以10（每分子rhGH的理論修飾位點(diǎn)），即可求得較為準(zhǔn)確的平均修飾率。該方法不僅可適用于單位點(diǎn)或多位點(diǎn)PEG-rhGH的平均修飾率測定，而且可有效鑒別不同生產(chǎn)廠家使用的不同種類的PEG，同時(shí)可測定原液中的游離PEG含量，實(shí)現(xiàn)一個(gè)方法進(jìn)行三項(xiàng)重要指標(biāo)的質(zhì)量控制。但是，目前該類方法可供參考的國內(nèi)外文獻(xiàn)極少，方法的建立需要投入較大的工作量。

　　PEG的修飾位點(diǎn)rhGH上可發(fā)生PEG修飾的位點(diǎn)有10個(gè)，即使均為單位點(diǎn)修飾，理論上也可能存在10種位點(diǎn)異構(gòu)體。同時(shí)，PEG分子本身是由一系列具有一定分子量分布的物質(zhì)組成的混合物，因此，每一種位點(diǎn)異構(gòu)體也就成為了較復(fù)雜的混合物。這就給PEG修飾位點(diǎn)的測定帶來了巨大的難度。目前可采用2種方法進(jìn)行PEG修飾位點(diǎn)的測定：液相肽圖法與離子交換分離位點(diǎn)異構(gòu)體法。這兩種方法都需要結(jié)合質(zhì)譜，對(duì)rhGH液相肽圖中的色譜峰準(zhǔn)確定性。在此基礎(chǔ)上，前者推斷修飾位點(diǎn)，后者可較為準(zhǔn)確地測得修飾位點(diǎn)。

　　液相肽圖法首先需建立適宜的rhGH與PEG-rhGH的酶切方法。由于PEG是具有枝杈結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合后，由于其空間位阻的屏蔽作用，使得蛋白酶很難作用于PEG-rhGH，這也是PEG-rhGH在體內(nèi)具有較長半衰期的原因。因此，對(duì)于PEG-rhGH，不能照搬rhGH藥典酶切方法，應(yīng)深入研究個(gè)酶切參數(shù)，使得蛋白酶既能完全水解rhGH與PEG-rhGH，得到盡可能多的理論肽段，又能避免非特異性酶切片段的產(chǎn)生。

　　隨后應(yīng)建立適宜的反相液相肽圖分離方法。一個(gè)經(jīng)過優(yōu)化的RP-HPLC液相肽圖，是控制PEG-rhGH修飾位點(diǎn)最直觀和便利的方法。因此，不可照搬rhGH藥典液相肽圖法，需反復(fù)優(yōu)化色譜分離條件，使得通過比較修飾前后的肽圖，既可推斷PEG的修飾位點(diǎn)，又可將不同種類的PEG-rhGH與rhGH區(qū)分開。

　　二硫鍵未被還原的rhGH經(jīng)胰蛋白酶酶切后，應(yīng)產(chǎn)生19個(gè)理論肽段，除去3個(gè)極性很強(qiáng)無法保留的肽段T3、T5、T18以及1個(gè)僅含有1個(gè)lys的T17，應(yīng)在RP-HPLC肽圖上出現(xiàn)至少15個(gè)肽段。同時(shí)通過還原酶切液，可推斷兩個(gè)二硫鍵肽段T20-SS-T21與T6-SS-T16的色譜峰位置。由于T20-SS-T21本身不含有PEG的修飾位點(diǎn)，T19肽段也不含有PEG修飾位點(diǎn)，因此在PEG修飾前后rhGH的酶切液中，該肽段不會(huì)發(fā)生峰位置和峰面積的變化。那么在酶切完全的前提下，rhGH酶切液中各個(gè)肽段的峰面積與T20-SS-T21或T20的峰面積之比（k值），應(yīng)為一個(gè)相對(duì)固定的數(shù)值。而在PEG-rhGH的酶切液中，連有PEG的肽段，其保留時(shí)間將發(fā)生改變。雖然由于位點(diǎn)異構(gòu)體的存在，該位點(diǎn)仍有未被PEG化的肽段出現(xiàn)，但是這一位置肽段的k值與未修飾rhGH的k值比較，應(yīng)有所下降，且降低的程度反應(yīng)了被修飾肽段的相對(duì)含量。因此，通過大量實(shí)驗(yàn)，可累積獲得rhGH與PEG-rhGH各肽段的平均k值，根據(jù)兩者的k值變化，可以推斷哪些位點(diǎn)發(fā)生了主要的修飾及修飾肽段的大致含量。

　　由于有些PEG的位點(diǎn)異構(gòu)體所占比例可能較低，難以通過k值變化進(jìn)行測定，應(yīng)盡可能對(duì)主要修飾肽段進(jìn)行控制。方法成功建立后，除了可用于原液的鑒別檢查外，還可在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)生主要修飾的肽段，其峰面積百分比不得超過的限值。由該方法確立的主要修飾位點(diǎn)及所占比例，可通過兩種以上蛋白酶酶切及陽離子交換色譜與等電聚焦電泳進(jìn)行深入的驗(yàn)證分析。本文由對(duì)照品網(wǎng)整理提供如涉及文章版權(quán)問題請(qǐng)聯(lián)系作者刪除，文章轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明地址：www.52lvdd.cn

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