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		儀器子系統(tǒng)的設(shè)計選擇會影響檢測

　　基因芯片技術(shù)研究做出了巨大貢獻，在許多領(lǐng)域，包括增長，老齡化，發(fā)病和進展，對藥物的反應(yīng)，在植物和動物的愈合。世界各地的研究人員繼續(xù)完善這項技術(shù)，把目光投向芯片的工具，為臨床診斷使用獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。什么是特別重要的是，微陣列成像系統(tǒng)應(yīng)該具有最高性能標(biāo)準(zhǔn)的芯片產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，為方便解釋。

　　任何熒光微陣列成像系統(tǒng)的基本要求是在樣品上，以激發(fā)熒光染料，收集發(fā)射的光，并生成數(shù)字圖像的熒光信號。兩種通用方法可用于獲得這樣的圖像：激光激發(fā)，用光電倍增管（PMT）檢測器，并過濾白色光激發(fā)用的電荷耦合器件（CCD）檢測器1-4此外，基于激光的系統(tǒng)。使用一個非共聚焦或光路。盡管這兩個結(jié)果在這些平臺的微陣列樣品數(shù)字圖像中，在構(gòu)建這樣的工具的設(shè)計選擇，可以顯著地影響系統(tǒng)的整體性能。

　　檢測限，場均勻性和重現(xiàn)性的微陣列成像精度是最重要的指標(biāo)，尤其是在發(fā)展中國家的診斷不確定性的余地不大。光傳輸，光收集和信號處理儀器子系統(tǒng)的設(shè)計都影響這些指標(biāo)的表現(xiàn)。

　　熒光微陣列圖像采集激發(fā)光交貨。在以激光為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中，一個單波長的激光束的直徑為幾微米的掃描背部和來回的樣品，令人興奮的一次單個像素的區(qū)域代表。發(fā)射光通過激勵透鏡行進，并收集由PMT表。PMT的每個光子的信號，然后將其轉(zhuǎn)換成數(shù)字值，用于表示各像素位置處的信號強度，以創(chuàng)建一個圖像進行放大。

　　在一個白色的光系統(tǒng)中，一種廣譜如氙燈或水銀燈的白光光源提供激勵光。激發(fā)波長選擇通過過濾的白光分解成更窄的波長范圍內(nèi)。在該指示燈點亮大面積的樣品，并收集被一個固定的CCD陣列的整個視場的熒光發(fā)射。不同的時間，讓收集到足夠的光從樣品中創(chuàng)建一個代表圖像的CCD成像光圈打開。CCD陣列上的各像素位置處的信號強度，然后轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。

　　激光照明集中在上面的樣品表面的一個小點的高功率的單色光。更高的功率密度，可提供更多的光的熒光分子，因此，少得多的時間需要用過濾的白色光激發(fā)的染料比。由于激光束掃描樣品，“住”在每個像素位置為幾微秒。與此相反，一個白色光源照在樣品上幾秒鐘或幾分鐘，而CCD集成在整個曝光時間發(fā)射信號。

　　發(fā)射光系列兩個重要的檢測器的特征，有助于系統(tǒng)的整體性能的線性范圍和量子效率。線性范圍表示的范圍內(nèi)的輸入信號強度超過該檢測器可以準(zhǔn)確地測量變化，例如，一個給定的輸入信號變化的程度會產(chǎn)生相同的輸出信號的變化程度。通常指定為電流之間的差異的本底噪聲和最高增益設(shè)置的線性范圍內(nèi)的PMT。例如，由濱松公司（新澤西州Bridgewater）濱松R3896 GenePix的微陣列掃描儀，用于在由：Axon儀器公司（盟市，加利福尼亞州）0.01-100μA，或四個數(shù)量級的范圍內(nèi)。從光電倍增管輸出的信號被轉(zhuǎn)換成一個16位的數(shù)字值，這意味著可分為216 = 65535步，覆蓋約4.5個數(shù)量級的強度值。通過改變電壓施加到它，這就決定了放大（增益）的信號作為電子穿過的PMT。4從光電倍增管輸出的信號的幅度調(diào)整

　　光電倍增管具有一個最佳的工作的線性范圍內(nèi)，在其上信號的反應(yīng)是最準(zhǔn)確的。如果增益設(shè)置低于此范圍，每個入射的光子將被轉(zhuǎn)換成一個電子的概率降低了。超過這個范圍，噪聲開始干擾信號測量準(zhǔn)確。對于濱松R3896，最佳的工作范圍是從500到1000，V.如果在此范圍內(nèi)，信號與噪聲之比的高，中，低強度的斑點的任何地方設(shè)置PMT增益不改變（參見圖1）。用戶可以在不同的電壓掃描不同樣品知道任何差異是由于生物效應(yīng)，不掃描參數(shù)。例如，GenePix的掃描儀中的PMT可以測量信號的變化，在約4個數(shù)量級在任何給定的電壓。 CCD檢測器的線性范圍內(nèi)，指定作為CCD陣列上的各孔中讀出的噪聲電平（即，在每個像素中測量的波動，由于隨機誤差）的容量的比率。例如，常用的CCD陣列可能有井深20000電子（E-10，2000年的線性范圍，或約三個量級）和讀出噪聲。

　　大多數(shù)生命科學(xué)成像中所用的CCD的12-bit數(shù)字分辨率可分為212 = 4096步，或約3.5個數(shù)量級的信號值。的CCD的信號強度范圍內(nèi)調(diào)整，通過改變曝光時間。喜歡一個PMT，CCD陣列也線性增加積分時間。然而，暗電流，或信號所產(chǎn)生的隨機流過器件的電子在沒有光的情況下，按比例增加隨曝光和可能增加背景信號。

　　重要的是要注意，雖然一個CCD攝像機具有比線性范圍較窄的光電倍增管，熒光染料分子的線性范圍內(nèi)的生物樣品殘留在所有的處理步驟之后很少超過2.5個數(shù)量級。對于大多數(shù)生物應(yīng)用中，任一系統(tǒng)中的線性范圍應(yīng)該是合適的。為了充分利用在一個給定的圖像的最大范圍，亮點不飽和檢測器的儀器設(shè)置在任一系統(tǒng)中應(yīng)設(shè)置。如果一個系統(tǒng)演示線性的性能廣泛的設(shè)置，用戶可以選擇一個單一的設(shè)置給定類型的所有芯片樣品，從而消除變異的來源之一，更容易辨別哪些其他實驗誤差的來源和真實的生物學(xué)差異。

　　檢測器的另一個重要特性是量子效率（QE），裝置發(fā)射相對于它接收輸入的光子信號的電子信號的措施。作為一個獨立的組成部分，大部分使用的CCD芯片成像系統(tǒng)有大約比標(biāo)準(zhǔn)光電倍增管的雙重更大??的QE。然而，在CCD和其它設(shè)計參數(shù)的12-bit數(shù)字分辨率的局限性，可以遠大于的好處更大QE。例如，收集單個圖像的顯微鏡載片上的大小足夠大的CCD陣列是極其昂貴的。CCD成像系統(tǒng)捕捉多個圖像的樣品，然后將它們縫合在一起創(chuàng)建一個單一的形象。不精確的拼接，漂白，由于重疊區(qū)域和其他文物的多重曝光可以影響準(zhǔn)確定量。過度拼接的另一種方法可能是使用了用于相機的鏡頭減少到一個較小的CCD表面的面積比較大的微陣列。然而，在所有的光學(xué)系統(tǒng)中，如果檢測器是小于源，光收集效率的損失是不可避免的。

　　共聚焦與非共光學(xué)?；诩す獾奈㈥嚵袙呙鑳x，共聚焦非共光路設(shè)計可以使用。最初開發(fā)共聚焦光學(xué)圖像薄切片厚的樣品，例如細(xì)胞或組織（參見圖3）。，5共焦光學(xué)系統(tǒng)創(chuàng)建一個很窄的焦點深度，拒絕信號從窄的焦平面超出。在不同深度的重復(fù)掃描創(chuàng)建多個高品質(zhì)的光學(xué)部分可以改造成厚樣品的3-D圖像。與此相反，在微陣列上，大部分的背景從非特異性結(jié)合的滑動面，這是在同一平面上的焦點作為樣品。芯片掃描共聚焦成像沒有優(yōu)勢?？梢允顾鼈兓瑒踊蚧瑒蛹艿钠教苟鹊募?xì)微變化特別敏感，在共聚焦系統(tǒng)的聚焦深度的非常窄的。

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