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		自動(dòng)圖像分析技術(shù)提供標(biāo)準(zhǔn)化和定量測(cè)量

　　在一個(gè)典型的AQUA實(shí)驗(yàn)測(cè)量靶基因表達(dá)于上皮性癌，4'-6-二脒基-2 - 苯基用于核掩模（UV通道），抗細(xì)胞角蛋白抗體識(shí)別和區(qū)分上皮細(xì)胞基質(zhì)（腫瘤掩模，用于），并建立了細(xì)胞質(zhì)面具（CY2和/或Cy3的通道），以及針對(duì)目標(biāo)的抗體用于可視化的靶基因的蛋白表達(dá)興趣（Cy5和/或CY7通道）。然而，AQUA實(shí)驗(yàn)并不限于這些參數(shù)。根據(jù)不同的組織/車(chē)廂希望的掩模，實(shí)驗(yàn)中采用了一些不同的掩蔽標(biāo)記。例如，在GBM的研究的情況下，神經(jīng)元細(xì)胞，膠質(zhì)纖維酸性蛋白可以用于定義一個(gè)遮蔽區(qū)域。

　　一旦組織已適當(dāng)染色，圖像采集可以繼續(xù)使用PM2000系統(tǒng)HistoRx公司。PM2000平臺(tái)是一個(gè)自動(dòng)落射熒光顯微鏡與隨附AQUAsition的圖像采集軟件系統(tǒng)，是專(zhuān)為高分辨率自動(dòng)化組織芯片和整個(gè)組織切片的圖像采集。

　　，AQUA得分的基礎(chǔ)是基于像素的區(qū)域設(shè)置分配條塊的表達(dá)（位置）的圖像分析算法。4組織是一種復(fù)雜的混合物中的各種組織成分（即，上皮細(xì)胞，間質(zhì)，血管）和亞細(xì)胞成分（即，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核，膜）。地方使差分圖像像素強(qiáng)度本地化相關(guān)的靶基因的表達(dá)，在這些不同的組件或口罩。在傳統(tǒng)的AQUA軟件，通過(guò)一系列的像素的強(qiáng)度閾值的步驟定義的掩模，產(chǎn)生二進(jìn)制圖像，然后通過(guò)圖像排除的步驟（參見(jiàn)圖2）。在下一代軟件中，將被隔離的執(zhí)行在一個(gè)完全無(wú)監(jiān)督的方式，使用簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)算法。

　　水族圖像分析。的Aqua分析過(guò)程中的示意性表示一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，看著上皮癌中的生物標(biāo)志物的表達(dá)。（1）通過(guò)像素強(qiáng)度閾值（二進(jìn)制門(mén)控）和空間圖像分析程序生成腫瘤面具。（2a和2b）代細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核特定像素面膜通過(guò)二進(jìn)制澆注。（3）結(jié)合細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核特定像素口罩100％相互排斥。（4）確定巧合的目標(biāo)像素與車(chē)廂像素（僅供可視）（點(diǎn)擊圖片放大）。

　　AQUA分析概述在圖2中，還提供了一個(gè)一步一步的插圖AQUA圖像分析來(lái)完成給定的一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)，例如使用目標(biāo)的雌激素受體 ??（ER）與上皮腫瘤。同樣，這AQUA分析可以被應(yīng)用到不同的排列，這取決于應(yīng)用程序。

　　AQUA分析通過(guò)像素強(qiáng)度閾值（二進(jìn)制選通）和空間的圖像分析程序（即，填充孔，參見(jiàn)圖2a和c）通過(guò)產(chǎn)生腫瘤掩模的開(kāi)始。確定腫瘤掩模像素作為模板，使用相同類(lèi)型的像素強(qiáng)度閾值是用來(lái)識(shí)別細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)像素（參見(jiàn)圖2d和e）。通過(guò)100％的互斥的處理，這些圖像組合，以提供像素分配條塊（參見(jiàn)圖2f）。AQUA得分產(chǎn)生，它代表的像素的濃度的目標(biāo)像素強(qiáng)度/隔室面積的總和。為了可視化的目的，步驟4在圖2中示出的目標(biāo)圖像的重疊（顏色為紅色）隔室ER的細(xì)胞核（在紅色與藍(lán)色的核從覆蓋的目標(biāo)像素的品紅圖象展示共定位;圖2小時(shí)）。

　　標(biāo)準(zhǔn)化由于IHC傳統(tǒng)的主觀和定性，跨實(shí)驗(yàn)室和觀察員的標(biāo)準(zhǔn)化是有問(wèn)題的。由于AQUA技術(shù)是客觀和嚴(yán)格定量的，也可以是標(biāo)準(zhǔn)化，儀器，實(shí)驗(yàn)室，和運(yùn)營(yíng)商。HistoRx公司已開(kāi)發(fā)的儀器校準(zhǔn)方法，使多個(gè)儀器上捕獲的信號(hào)進(jìn)行歸。11這種標(biāo)準(zhǔn)化是通過(guò)光源和內(nèi)在機(jī)校準(zhǔn)方法的組合。這些方法是自動(dòng)化和使用穩(wěn)定的非生物材料，主校準(zhǔn)完成實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集。

　　軟件算法的方法已經(jīng)被發(fā)展為主要?jiǎng)h除操作員決定從圖像采集（即，自動(dòng)曝光）和得分的過(guò)程（即，無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)的基于像素的）10在這些方法也可以被應(yīng)用到任何目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的CV還小于5％，這是與其它定量免疫測(cè)定法（例如，酶聯(lián)免疫吸附，流式細(xì)胞儀）相媲美。此外，這些標(biāo)準(zhǔn)化方法已應(yīng)用到眾多的標(biāo)記，包括mTOR的HER2，EGFR，ER和PTEN 10,11。

　　開(kāi)發(fā)臨床診斷的重要的是能夠再現(xiàn)病人分類(lèi)。例如，目前的ASCO-CAP指南建議，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)達(dá)到95％的正/負(fù)目前HER2檢測(cè)方法的一致性，12最近的一項(xiàng)研究表明，對(duì)于HER2蛋白的得分，介于54％至85％之間的一致性實(shí)驗(yàn)室，這些準(zhǔn)則低于13正/負(fù)一致性檢查工具，跨運(yùn)營(yíng)商，和染色天AQUA得分。整體一致性從94.5％到99.3％不等。

　　這些分析包括所有案件，包括那些將被視為模棱兩可的標(biāo)準(zhǔn)IHC方法，并會(huì)受到反折到一個(gè)不同的方法（即熒光原位雜交）。因此，AQUA分析可以得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白表達(dá)得分與一個(gè)單一的方法以獲得更多的樣品，同時(shí)仍然允許維持典型的病理實(shí)驗(yàn)室的工作流程提供了一個(gè)平臺(tái)。

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