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		影響中空纖維生物反應(yīng)器抗體生產(chǎn)效率的因素

　　10000他的生產(chǎn)效率-并使用左旋公司，Acusyst小和Unisyn科技公司30,000兆瓦截止中空纖維生物反應(yīng)器盒，CP2000的生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行了研究。兩個墨盒的類型產(chǎn)生顯著數(shù)量的小鼠單克隆抗體，但生產(chǎn)效率（毫克抗體每升培養(yǎng)基中消耗的制造）更高的30000兆瓦墨盒。此外，較小的孔徑盒抗體生產(chǎn)和26至33天與11?20天為30,000兆瓦盒細(xì)胞生長所顯示的延長滯后期。高內(nèi)毛細(xì)管介質(zhì)的進(jìn)料速率（5.0升/天為30,000 MW和8.4升/天為10,000 MW）可能會降低整體抗體的生產(chǎn)效率，并降低進(jìn)料速率（3.5和7.2升/天，分別）可能每升產(chǎn)生更多的抗體介質(zhì)消耗。

　　從匯合的生物反應(yīng)器濾芯的定期除去過量的細(xì)胞可以增加抗體的產(chǎn)生和擴(kuò)展的游程的長度?？贵w的批量收獲可能會導(dǎo)致更多的高濃縮抗體比連續(xù)收獲。

　　使用中空纖維筒作為基質(zhì)用于雜交瘤細(xì)胞生長的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的生產(chǎn)單克隆抗體的multigram量的有效方法。13的空心纖維筒可產(chǎn)生從污染的細(xì)胞或血清蛋白的高度濃縮的單克隆抗體相對自由。4這些墨盒，可主要在10,000（如腎透析盒）分子量孔徑或只在生物反應(yīng)器系統(tǒng)生產(chǎn)的大孔徑的配置。

　　使用左旋公司（明尼阿波利斯），Acusyst小和Unisyn Technologies公司（加利福尼亞州Tustin），CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，我們調(diào)查了幾種類型的中空纖維筒的維持小鼠雜交瘤細(xì)胞的生長的能力和，以產(chǎn)生抗體。我們還研究了幾個關(guān)鍵的運(yùn)行參數(shù)，包括中等進(jìn)給率，抗體收獲方法，細(xì)胞去除，和葡萄糖利用率（GUR）對抗體產(chǎn)生的影響。

　　材料和方法

　　細(xì)胞系。鼠雜交瘤VA1 18D7.3.2.4（antivalproic酸）（IgG1的），鐵道部9B1（antimorphine）（IgG1的），METH7-4B6（IGA）（antimethamphetamine），和PCP1.9D10（IgG1的）（antiphencyclidine）生長在Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基（IMDM）（敏達(dá)公司，赫恩登，VA），補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺（Gibco公司，格蘭德島，NY）和10％胎牛血清（FBS）（Hyclone公司實驗室，洛根，猶他州）。采用國家統(tǒng)計局融合伙伴生成所有的雜交瘤。

　　基線靜態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)率對于每種細(xì)胞系，建立了5×10重復(fù)播種4個細(xì)胞/在生長培養(yǎng)基（如上所述），在標(biāo)準(zhǔn)的T25燒瓶毫升（康寧，康寧，紐約州）。將培養(yǎng)瓶置于37℃，7％CO 2 72小時，然后除去培養(yǎng)基，并以1000rpm離心10分鐘。得到的上清液中測定總的和特異性免疫球蛋白通過ELISA（表I），如于下文中描述的“抗體濃度的測定。” （表尚未公布上線。）

　　生物反應(yīng)器系統(tǒng)和中空纖維筒。的Acusyst Jr。被用Acucell 1100（左旋，Inc。）的10,000兆瓦墨盒表面面積的19呎和120毫升毛細(xì)管外空間（ECS）（表一）中運(yùn)行。墨盒采用了逆流循環(huán)過程，以積極地輸送介質(zhì)來回的內(nèi)毛細(xì)管（ICS）和ECS之間。該系統(tǒng)是獨特的Acusyst Jr。和其cultureware并且是不可用于測試的其他墨盒或系統(tǒng)。

　　CP2000的比較采用其他兩種10,000兆瓦墨盒：本Clirans T220銅氨纖維腎透析盒（19平方英尺的面積，100毫升ECS）（Terumo Corp。制造，新澤西州Somerset）和BR2010兩性共聚物膜墨盒（35平方英尺的面積，210毫升ECS）（Unisyn技術(shù)公司，加利福尼亞州Tustin）。這些也較BR3530醋酸纖維素30000兆瓦的生物反應(yīng)器，從Unisyn技術(shù)暗盒公司（表I）。

　　一般生物反應(yīng)器的運(yùn)行參數(shù)。的小鼠雜交瘤培養(yǎng)物中的IMDM制劑。在對數(shù)生長期（> 85％存活通過臺盼藍(lán)排除法）離心細(xì)胞，在400×g離心5分鐘，然后在新鮮的生長培養(yǎng)基中重懸。約10 9則細(xì)胞被引入到每一個生物反應(yīng)器筒的精英由一個大的注射器。

　　中空纖維生物反應(yīng)器中進(jìn)行了墨盒的兩個生物反應(yīng)器系統(tǒng)與如上所述的IMDM測試。FBS的濃度在ICS介質(zhì)的所有生物反應(yīng)器實驗中，除了那些使用鐵道部9B1和PCP1.9D10分別為3％，第20公升的媒體和1％，為余下的實驗。在ICS中的MOR 9B1和PCP1.9D10運(yùn)行的FBS濃度為3％在整個實驗過程中。血清濃度為MOR 9B1和PCP1.9D10實驗貫穿保??持在10％以上。對ECS的FBS濃度為其他細(xì)胞系中逐漸從10到1％通過引入ICS料培養(yǎng)基整個實驗過程中降低。

　　每個生物反應(yīng)器運(yùn)行的運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行操縱，以最大限度地提高生產(chǎn)力。他們根據(jù)細(xì)胞系，生物反應(yīng)器系統(tǒng)，以及生物反應(yīng)器中盒的要求而變化。最初的毛細(xì)血管內(nèi)再循環(huán)率對于每個CP2000運(yùn)行的范圍350和550毫升/分鐘之間，并逐漸增加至999毫升/分鐘的最大設(shè)定值。該Acusyst小的再循環(huán)率為200至400毫升/分鐘。它不能用，因為泵系統(tǒng)限制的再循環(huán)率> 400 ml / min的運(yùn)行。溫度自動地由這兩個系統(tǒng)，在37±0.5℃下維持在100％空氣和二氧化碳的流速分別保持在約100和510厘米3 /分鐘，分別貫穿每個CP2000運(yùn)行的過程。pH值對運(yùn)行6.9和7.3之間不等。

　　的葡萄糖利用率的測定。的GUR是細(xì)胞代謝和細(xì)胞生長的指示劑。5的墨盒，以維持細(xì)胞的生長的相對能力，通過測定葡萄糖的量由所用的細(xì)胞在ICS評估。在循環(huán)生物反應(yīng)器的ICS培養(yǎng)基葡萄糖濃度用羅氏血糖試劑與羅氏校準(zhǔn)的血清對COBAS生物儀器（全部來自羅氏診斷系統(tǒng)公司，薩默維爾，新澤西州）確定。

　　具有低古爾生物反應(yīng)器可能有太少代謝活躍的細(xì)胞表現(xiàn)出足夠的抗體產(chǎn)生。高GUR可以導(dǎo)致劇烈的過度生長和過早衰老。我們，因此，建立一個目標(biāo)GUR為不同的生物反應(yīng)器配置。在目標(biāo)GUR，運(yùn)行參數(shù)，如介質(zhì)的進(jìn)給率和再循環(huán)率進(jìn)行了優(yōu)化，以最大限度地提高抗體的產(chǎn)生。目標(biāo)GUR是通過在不同介質(zhì)中的進(jìn)給速率增長的每一個細(xì)胞系實驗來確定的，它依賴于細(xì)胞系和墨盒。250毫克/小時的目標(biāo)GUR每個生物反應(yīng)器體系的建立。

　　的GUR（表示為mg /小時），通過下式確定：

　　GUR = {進(jìn)給速度（毫升/小時）×[葡萄糖（毫克/升）葡萄糖滿分（毫克/升）]} / 1000

　　其中葡萄糖在葡萄糖是在進(jìn)入生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的補(bǔ)料培養(yǎng)基的濃度，和葡萄糖，滿分為葡萄糖的再循環(huán)介質(zhì)中的濃度。

　　抗體濃度的測定。分泌抗體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的濃度用ELISA測定。九十六個孔 ??微量滴定板（Costar公司，劍橋，MA），預(yù)先涂有drugbovine血清白蛋白（BSA）的結(jié)合物被封鎖以防止與在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）/疊氮化物1％BSA的非特異性結(jié)合。培養(yǎng)上清的系列稀釋液從生物反應(yīng)器ECS繪制被應(yīng)用到特定的板，并通過將已知濃度的純化抗體在上板平行孔中產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測定。

　　將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的孵育后，未結(jié)合的抗體除去洗滌該板在PBS /吐溫20（Sigma公司生物化學(xué)試劑，圣路易斯）。結(jié)合的抗體，通過加入堿的檢測phosphataselabeled抗鼠抗體（Zymed公司，舊金山）?？贵w的濃度在405nm處有一個CR340板讀數(shù)器（SLT公司，奧地利薩爾茨堡）用分光光度計測量，并使用ELISA 3.0版計算機(jī)軟件（Meddata公司，紐約市）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

　　標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長和抗體產(chǎn)生，抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞生長的Clirans T220，BR2010，以及Acucell 1100中空纖維筒的比率進(jìn)行了比較，那些Unisyn BR3530墨盒。為了保持一致性，分別用于運(yùn)行之間的比較武斷的標(biāo)準(zhǔn)。一個準(zhǔn)則是達(dá)到250毫克/小時的目標(biāo)GUR水平所需的天數(shù);另一個是需要產(chǎn)生1克抗體的天數(shù)。這些標(biāo)準(zhǔn)定義的滯后期在不同墨盒或不同的細(xì)胞系或一個給定的墨盒條件下生長的相同細(xì)胞系的比較。

　　孔徑對抗體產(chǎn)生的影響通過抗體的產(chǎn)生量（單位為毫克）的測定每升ICS的測定飼料介質(zhì)消耗過一段時間（生產(chǎn)效率）。由于運(yùn)行在不同時間，40天是任意選擇的是代表每次運(yùn)行。最后一個標(biāo)準(zhǔn)是由運(yùn)行40天產(chǎn)生（克）總的抗體。

　　使用VA1 18D7細(xì)胞系，我們比較了抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞生長中使用Clirans T220（泰爾茂株式會社制造，薩默塞特，新澤西州）中，BR3530，并且BR2010（Unisyn Technologies公司）的生物反應(yīng)器的CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)的速率墨盒。在MOR 9B1細(xì)胞系用于將Acusyst小的生物反應(yīng)器系統(tǒng)和Acucell 1100墨盒抗體產(chǎn)生和細(xì)胞生長中的CP2000生物反應(yīng)器系統(tǒng)使用BR3530盒（表I）的比率進(jìn)行比較。

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