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發(fā)光細(xì)菌作為毒性檢測(cè)的生物學(xué)方法，因其簡(jiǎn)便、快速、靈敏且成本較低而日益受到重視。本試驗(yàn)項(xiàng)目推薦兩個(gè)方法。一為國(guó)家環(huán)境保護(hù)局于1995年發(fā)布的發(fā)光細(xì)菌法（GB/T15441-1995)，采用的是海洋發(fā)光細(xì)菌菌種；二為淡水發(fā)光菌法，采用的是淡水型發(fā)光菌種。
明亮發(fā)光桿菌T3法（A)
本方法適用工業(yè)廢水、納污水體及實(shí)驗(yàn)室條件下，可溶性化學(xué)物質(zhì)的水質(zhì)急性毒性監(jiān)測(cè)。
1．原理
基于發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光度與水樣毒性組分總濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤0.05)，因而可通過生物發(fā)光光度計(jì)測(cè)定水樣的相對(duì)發(fā)光度，以此表示其急性水平。
水質(zhì)急性毒性水平可按選用相當(dāng)?shù)膮⒈任锫然瘽舛龋ㄒ詍g/L為單位）來表征，或選用EC50值（半數(shù)有效濃度，以樣品液百分濃度為單位）來表征。
2．樣品的采集與保存
?、俨蓸悠渴褂镁鬯姆蚁┮r墊的玻璃瓶，務(wù)必清潔、干燥。采集水樣時(shí)，瓶?jī)?nèi)應(yīng)充滿水樣不留空氣。采樣后，用塑膠帶將瓶口密封。
?、诙拘詼y(cè)定應(yīng)在采樣后6h內(nèi)進(jìn)行。否則應(yīng)在2-5℃下保存樣品，但不得超過24h。報(bào)告中應(yīng)寫明水樣采集時(shí)間和測(cè)定時(shí)間。
?、蹖?duì)于含固體懸浮物的樣品須離心或過濾去除，以免干擾測(cè)定。
3．儀器設(shè)備
①生物發(fā)光光度計(jì)：配置2ml或5ml測(cè)試管。
當(dāng)氯化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.10mg/L時(shí)，發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度為50%，其誤差不超過±10%。
?、?ml或5ml測(cè)試樣品管（具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，為制造比色管的玻璃料制作，由專業(yè)玻璃儀器廠制造），分別適用于相應(yīng)型號(hào)的生物發(fā)光光度計(jì)。
?、畚⒘孔⑸淦鳎?0μl。
?、茏⑸淦鳎簂ml。
?、荻考右浩浚?ml。
⑥吸管：2ml、10m1、25ml。
?、咴噭┢浚簂00ml。
?、嗔客玻?00ml,500ml。
?、嶙厣萘科浚?0ml、250ml、1000ml。
?、獍胛⒘康味ü埽ㄅ淠タ谠囈浩浚變x器均為棕色）：l0ml。
4．試劑和材料
除另有說明外，本方法所用試劑均應(yīng)為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?、蒸餾水或同等純度的水。
?、俾然疕gCl2。
?、诼然cNaCl，化學(xué)純。
?、勖髁涟l(fā)光桿菌T3小種（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）凍干粉，安瓶瓶包裝，每瓶0.5g，在2-5℃冰箱內(nèi)有效保存期為6個(gè)月。新制備的發(fā)光細(xì)菌休眠細(xì)胞（凍干粉）密度不低于每克800萬個(gè)細(xì)胞；當(dāng)按5(3)④步驟將凍干粉復(fù)蘇2min后即發(fā)光（可在暗室內(nèi)檢驗(yàn)，肉眼應(yīng)見微光），稀釋成工作液后每毫升菌液不低于1.6萬個(gè)細(xì)胞（(5ml測(cè)試管）或2萬個(gè)細(xì)胞（2ml測(cè)試管）（均為稀釋平板法測(cè)定）。在生物發(fā)光光度計(jì)上測(cè)出的初始發(fā)光量應(yīng)在600-1900mV之間，低于600mV允許將倍率調(diào)至“×2”檔，高于1900mV允許將倍率調(diào)整至“×0.5”檔。仍達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)者，更換凍干粉。
?、苈然c溶液，3g/100m1：氯化鈉3g于玻璃容器內(nèi)，用量筒加蒸餾水l00ml。
?、萋然c溶液，2g/l00ml氯化鈉2g，加蒸餾水l00ml于試劑瓶?jī)?nèi)，2-5℃保存。
⑥參比物氯化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
⑦氯化汞母液，ρ=2000mg/L:1/萬分析天平精稱密封保存良好的無結(jié)晶水氯化汞0.1000g于50ml容量瓶中，用3g/100m1氯化鈉溶液稀釋至刻度，置2-5℃冰箱備用，保存期6個(gè)月。
?、嗦然ぷ饕海?rho;=2mg/L：用移液管吸氯化汞2000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中，用3g/l00ml氯化鈉溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml于250m1容量瓶中，用3g/l00m]氯化鈉溶液定容。將此液倒入配有半微量滴定管的試液瓶，然后用3g/l00ml氯化鈉溶液將氯化汞2mg/L溶液按表5-3-6稀釋成系列濃度（一律采用50ml容量瓶）。氯化汞工作液保存期不能超過24h，超過者務(wù)必重配。
5.試驗(yàn)程序
(1)稀釋樣品液
?、贅悠芬簻y(cè)定前稀釋的條件：
樣品液預(yù)試驗(yàn)：取事先加氯化鈉至3g/l00ml濃度的樣品母液2m1裝入樣品管，并設(shè)一支CK管（氯化鈉3g/100m1溶液），按4②一③所述測(cè)定相對(duì)發(fā)光度。
若測(cè)得的樣品，相對(duì)發(fā)光度低于50％乃至零，欲以EC50表達(dá)結(jié)果，則需稀釋。
若測(cè)得的樣品，相對(duì)發(fā)光度在1％以上，欲以與相對(duì)發(fā)光度相當(dāng)?shù)穆然瘽舛缺磉_(dá)結(jié)果，則不需稀釋。
?、跇悠芬旱南♂屢海簶悠芬旱南♂屢阂宦捎谜麴s水，在定容前一律按構(gòu)成氯化鈉3g/100ml的濃度添加氯化鈉或濃溶液（母液只能加固體）。
?、蹣悠芬合♂対舛鹊倪x擇：
預(yù)試驗(yàn)：按對(duì)數(shù)系列將樣品液稀釋成五個(gè)濃度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%（其對(duì)數(shù)依次為0、-1、-2、-3、-4)，按5(2）和5(3）所述粗測(cè)一遍，視1％-100%相對(duì)發(fā)光度落在哪一濃度范圍。
正式試驗(yàn)：在1%-100％相對(duì)發(fā)光度所落在的濃度范圍內(nèi)增配到6-9個(gè)濃度（例如，若落在0.1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%；若落在1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%)，按5(2）-(3)所述再測(cè)一遍；這6-9個(gè)濃度，也可通過查對(duì)數(shù)表，按等對(duì)數(shù)間距原則自行確定（例如，若落在1％-10％之間，則應(yīng)稀釋成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其對(duì)數(shù)相應(yīng)為1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00，對(duì)數(shù)間距均為0.2)。
(2)測(cè)定條件
?、偈覝兀?0-25℃。
同一批樣品在測(cè)定過程中要求溫度波動(dòng)不超過±1℃，且所有測(cè)試器皿及試劑、溶液測(cè)前1h均置于控溫的測(cè)試室內(nèi)。
②pH：若需測(cè)定包括pH影響在內(nèi)的急性毒性，不應(yīng)調(diào)節(jié)待測(cè)樣品pH。
若需測(cè)定排除pH影響在內(nèi)的急性毒性，需在測(cè)定前將待測(cè)樣品和CK（氯化鈉3g/100m1）的pH調(diào)至下值：主要含Cu的水樣為4.5，主要含其他金屬的水樣為5.4，主要含有機(jī)化合物的水樣為7.0。
?、廴芙庋酰罕痉ㄖ荒軠y(cè)定包括溶解氧影響在內(nèi)的急性毒性。
(3)測(cè)定步驟
①試管的排列：于塑料或鐵制試管架上按以下兩種情況排列測(cè)試管。
a．按5(1)①所述，樣品母液相對(duì)發(fā)光度為1％以上者，如下排列：
左側(cè)放參比物氯化汞系列濃度溶液管，右側(cè)放樣品管。前排放氯化汞溶液和樣品管，后一排放對(duì)照（CK）管，后二排放CK預(yù)試驗(yàn)管。每管氯化汞或樣品液均配一管CK（氯化鈉3g/100m1蒸餾水溶液）。設(shè)三次重復(fù)。每測(cè)一批樣品，均需同時(shí)配置測(cè)定系列濃度氯化汞標(biāo)準(zhǔn)溶液。
b．按5(1)①所述，樣品母液相對(duì)發(fā)光度為50％以下乃至零者，如下排列：
左側(cè)僅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作為檢驗(yàn)發(fā)光細(xì)菌活性是否正常的參比物濃度，其反應(yīng)15min后的相對(duì)發(fā)光度應(yīng)在50％左右），右側(cè)放樣品稀釋液管（從低濃度到高濃度依次排列）。其他同a。每測(cè)一批樣品，均需同時(shí)配測(cè)氯化汞0.10mg/L溶液。
?、诩?g/l00ml氯化鈉溶液：用5ml的定量加液瓶給每支CK管加2m1或5ml氯化鈉3g/l00ml（據(jù)儀器型號(hào)而定）。
?、奂訕悠芬海河?ml或5ml吸管給每支樣品管加2ml或5ml樣品液（據(jù)5(3)②而定）。每個(gè)樣品號(hào)換一支吸管。
?、馨l(fā)光細(xì)菌凍干菌劑復(fù)蘇
從冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g發(fā)光細(xì)菌凍干粉的安瓿瓶和氯化鈉溶液，投入置有冰塊1-1.5L保溫瓶，用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化鈉2g/l00m1（適用于5ml測(cè)試管）或lml冷的2.5%氯化鈉（適用于2m1測(cè)試管）注入已開口的凍干粉安瓿瓶，務(wù)必充分混勻。2min后菌即復(fù)蘇發(fā)光（可在暗室內(nèi)檢驗(yàn)，肉眼應(yīng)見微光）。備用。
⑤儀器的預(yù)熱和調(diào)零：打開生物發(fā)光光度計(jì)電源，預(yù)熱15min，調(diào)零，備用。
?、鄼z驗(yàn)復(fù)蘇發(fā)光細(xì)菌凍千粉質(zhì)量：另取一空2m1或5ml測(cè)試管加2m1或5ml氯化鈉3g/100ml（據(jù)5(3)②而定），加10μ1復(fù)發(fā)光菌液，蓋上瓶塞，用手顛倒五次以達(dá)均勻。拔去瓶塞，將該管放入各自型號(hào)儀器測(cè)試艙內(nèi)，若發(fā)光量立即顯示（或經(jīng)過5-l0min上升到）600mV以上，此瓶?jī)龈煞劭捎糜跍y(cè)試，低于者按4③處理。菌液發(fā)光量先緩慢上升，約持續(xù)5-15min，后緩慢下降，約持續(xù)4h。滿4h的CK發(fā)光量應(yīng)不低于400mV，低于者更換凍干粉。
?、呓o各測(cè)試管加復(fù)蘇菌液：在發(fā)光菌液復(fù)蘇穩(wěn)定（約0.5h)后，按5(3)所述，從左到右，按氯化汞或樣品管（前）-CK管（后）一氯化汞或樣品管（前）-CK管（后）…順序，用10μl微量注射器（勿用定量加液器以減少誤差）準(zhǔn)確吸取10μl復(fù)蘇菌液，逐一加入各管，蓋上瓶塞，用手顛倒五次，拔去瓶塞，放回原位（每管加菌液間隔時(shí)間勿短于30s。每管在加菌液的當(dāng)時(shí)務(wù)必精確計(jì)時(shí)，記錄到秒，即為樣品與發(fā)光菌反應(yīng)起始時(shí)間。立即將此時(shí)間加15min，記作各管反應(yīng)終止（即應(yīng)該讀發(fā)光量）的時(shí)間。
?、喟l(fā)光細(xì)菌與樣品反應(yīng)達(dá)到終止時(shí)間的讀數(shù)：按各管原來加菌液的先后順序，當(dāng)某管達(dá)到記錄的反應(yīng)終止時(shí)間，在不加瓶塞的情況下，立即將測(cè)試管放入儀器測(cè)試艙，讀出其發(fā)光量（以光信號(hào)轉(zhuǎn)化的電信號(hào)一電壓毫伏數(shù)表示）。
⑨有色樣品測(cè)定干擾的校正：
a．拿掉儀器樣品艙上的黑色塑料管口；
b．取－2m1測(cè)試管（直徑12mm)，加氯化鈉3g/ml溶液2m1，將該管放進(jìn)一裝有少量氯化鈉3g/100m1溶液的5ml管（直徑20mm）內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氯化鈉3g/l00ml液面平齊。此作CK管；
c．另取一2ml測(cè)試管，加氯化鈉3g/ml溶液2ml，放入另一裝有少量有色待測(cè)樣品液的5ml管內(nèi)，要使外管與內(nèi)管的氯化鈉3g/ml液面平齊。此作CKc管；
d．于CK和CKc二管的內(nèi)管中同時(shí)加復(fù)蘇發(fā)光菌液10μ1（注意：必須是本批樣品測(cè)
定所用同一瓶復(fù)蘇菌液），立即記時(shí)到秒，等反應(yīng)滿15min，迅速放入儀器測(cè)試艙，測(cè)定兩支帶有內(nèi)管的5ml測(cè)試管的發(fā)光量。分別記下發(fā)光量Ll(CK管）和L2(CKc管）；
e．計(jì)算因顏色引起的發(fā)光量（mV）校正值ΔL=L1一L2；
f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常規(guī)步驟測(cè)試帶色樣品管及其CK管（氯化鈉3g/l00ml溶液）的發(fā)光量（mV)。所有CK管測(cè)得之發(fā)光量（mV）均須減去校正值ΔL(mV）后才能作為CK發(fā)光量（mV)。
有色樣品溶液測(cè)定干擾的校正示意圖見圖5-3-1。
6．質(zhì)量保證與質(zhì)量控制
?、倜恐Оl(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性不盡相同，同批樣品測(cè)定過程中應(yīng)使用同一支發(fā)光菌，如果需做氯化汞標(biāo)準(zhǔn)曲線，也應(yīng)與樣品使用同一支發(fā)光菌。如果一支不夠用，可采用同批的兩支混合后使用。
?、趪?guó)際上一般通用反應(yīng)時(shí)間為5min或15min兩種，鑒于我國(guó)目前所用發(fā)光桿菌的靈敏度和穩(wěn)定性，采用15min。
?、廴沃貜?fù)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差確定為≤1％。
④測(cè)定應(yīng)在采集樣品后立即進(jìn)行，在6h內(nèi)不能測(cè)定應(yīng)低溫保存，但不得超過24h。
?、蓐P(guān)于樣品如何稀釋的問題，一般根據(jù)樣品毒性大小決定，但是在試驗(yàn)中至少要選擇六個(gè)不同濃度。如果六個(gè)濃度的相對(duì)發(fā)光度在1%-100％之外，可增配若干個(gè)濃度，使之落在1%-100％相對(duì)發(fā)光度范圍內(nèi)，以求相關(guān)方程。
⑥如果樣品濃度為最高極限濃度（即100%）時(shí)，其相對(duì)發(fā)光率都不能使發(fā)光強(qiáng)度減少50%，則對(duì)樣品的EC50值只能示為＞100%。
⑦鑒于發(fā)光細(xì)菌法實(shí)驗(yàn)因素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定誤差。在評(píng)價(jià)毒物的劑量一效應(yīng)關(guān)系時(shí)，應(yīng)確定95％置信區(qū)間，即T=a+bC±2SE（SE為剩余標(biāo)準(zhǔn)差），以此求出的EC50也有一定的區(qū)間，可根據(jù)這些結(jié)果確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，就大多數(shù)而言，一般EC50值的變異系數(shù)在6％-10%。
7.測(cè)試結(jié)果的表達(dá)
1)計(jì)算樣品相對(duì)發(fā)光度（％），并算出平均值：
相對(duì)發(fā)光度（%)=氯化汞管或樣品管發(fā)光量（mV)/CK管發(fā)光量（mV)×100
相對(duì)發(fā)光度（％）平均值＝（重復(fù)1）（%）+（重復(fù)2）（%）+（重復(fù)3）（%）/3
2）符合5(1)①中樣品母液相對(duì)發(fā)光度在1％以上者，建立并檢驗(yàn)氯化汞濃度（C)與其相對(duì)發(fā)光度（T，％）均值的相關(guān)方程，也可以繪制關(guān)系曲線。
①求出一元一次線性回歸方程的a（截距）、b（斜率、回歸系數(shù)）和r（相關(guān)系數(shù)），列出方程：
T=a+bC氯化汞
查相關(guān)系數(shù)顯著水平（P值）表，檢驗(yàn)所求r值的顯著水平。若P≤0.01，且EC50氯化汞=0.lomg/L±0.02mg/L，則所求相關(guān)方程成立；反之，不能成立，必須重測(cè)系列氯化汞濃度的發(fā)光量。氯化汞溶液配制過夜者，必須重配后再測(cè)定。
?、谝部梢該?jù)建立的上述方程繪制關(guān)系曲線。即指定發(fā)光度為10％和90%，代入上式，求出相應(yīng)的二個(gè)氯化汞濃度，在常數(shù)坐標(biāo)紙上，定出二點(diǎn)，畫一直線，即為符合該方程的氯化汞濃度與相對(duì)發(fā)光度的關(guān)系曲線。
3)符合5(1)①中樣品母液相對(duì)發(fā)光度低于50％乃至零，欲以EC50表示結(jié)果者，建立并檢驗(yàn)樣品稀釋濃度（C）與其相對(duì)發(fā)光度（T)均值的相關(guān)方程，繪制關(guān)系曲線。
按7之2)所述方法建立相關(guān)方程T=a+bC樣，并檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)r、顯著水平（P值）。
若P≤0.05，則所求相關(guān)方程成立；反之，不能成立，必須重測(cè)樣品稀釋系列濃度的發(fā)光量。
8．結(jié)果評(píng)價(jià)和報(bào)告
(1)用氯化汞濃度表達(dá)樣品毒性
1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對(duì)發(fā)光度＞1%）并按7之2)建立了合格（(P≤0.01、EC50氯化汞=0.10mg/L±0.02mg/L）的氯化汞濃度與其相對(duì)發(fā)光度相關(guān)方程者。
2）表達(dá)方法：
?、賹y(cè)得的樣品相對(duì)發(fā)光度，代入7之2)的相關(guān)方程，求出與樣品急性毒性相當(dāng)?shù)穆然瘽舛龋ㄒ话阌胢g/L）表示。
?、跍y(cè)試結(jié)果報(bào)告同時(shí)列舉樣品相對(duì)發(fā)光度及其相當(dāng)?shù)穆然瘽舛戎怠?/span>
3)適用性：適用于相對(duì)發(fā)光度在1％以上，特別是50％以上（即不可能出現(xiàn)EC50值）但低于100%（即仍有中、低水平毒性）的樣品毒性測(cè)定。
(2)用EC50值表達(dá)樣品毒性
1)適用的條件：符合條件（樣品母液相對(duì)發(fā)光度低于50％乃至零）并按7之3)建立了合格（P≤0.01）的樣品稀釋液濃度與其相對(duì)發(fā)光度相關(guān)方程者。
2）表達(dá)方法：
?、賹代入7之3)建立的相關(guān)方程，求出樣品的EC50值。這里的EC50值以樣品的稀釋濃度（一般用百分濃度）表示。
②測(cè)試結(jié)果報(bào)告列舉樣品的EC50值。
3）適用性：適用于相對(duì)發(fā)光度在50％以下，特別是零（即毒性水平較高或很高）的樣品毒性測(cè)定，后者無法以相當(dāng)?shù)穆然瘽舛缺磉_(dá)毒性。
(3）測(cè)定記錄格式（見表5-3-8)
(4）測(cè)定結(jié)果報(bào)告
?、賹?shí)驗(yàn)室室溫。
②采樣地點(diǎn)、日期、時(shí)間。
?、勐然瘽舛然驑悠废♂尠俜譂舛扰c相對(duì)發(fā)光度的相關(guān)方程：
T=a+bC
r= P≤ EC50氯化汞= mg/L
L=a+bC a= b=
回歸方程 r= P＜
④樣品EC50值（稀釋百分濃度）或相對(duì)發(fā)光度（％）及相當(dāng)?shù)穆然瘽舛龋╩g/L）。
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