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| 化學農(nóng)藥的過量施用使病原菌的抗藥性增強 | |||||||||||
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| 導致抗性作物品種經(jīng)常喪失抗性，另外化學農(nóng)藥的過量施用使病原菌的抗藥性增強，造成防治難度加大。有機農(nóng)藥使用后的殘留，造成對生物以及環(huán)境的破壞，一定水平上也造成對人體的危害。因此，隨著人們環(huán)保意識的增強，生物防治特別是生物農(nóng)藥的使用已成為防治植物病害的趨勢，市場對開發(fā)新型的生物農(nóng)藥也有著迫切的需求。植物在同病原物競爭進化過程中，已形成一系列防御機制，過敏反應(HR和系統(tǒng)獲得抗性(SA R就是這種防御機制的典型表示。某些小分子物質能夠誘導植物發(fā)生這種防衛(wèi)反應。這種防衛(wèi)反應的發(fā)生，可以抵抗多種多樣的病原物對植物的第二次侵染，類似于人或動物的免疫系統(tǒng)，利用植物的這種誘導抗病性和生物防治菌的特性來開發(fā)新型的生物農(nóng)藥應該十分可行。綠色木霉(Trichodermavirid一種腐生性生物防治微生物，其對植物病原真菌的拮抗作用包括競爭作用、重寄生作用及抗生作用等方面。如果用木霉來表達誘導植物抗病性蛋白，并利用木霉的腐生特點來傳達該蛋白，這將大大增加木霉的應用范圍，也為開發(fā)可持續(xù)利用的生物農(nóng)藥提供一條可行的途徑。為了驗證這種想法，使用了隱地疫霉(Phytophthoracryptogea分泌的隱地蛋白(Cryptogein,植物病害一直是制約農(nóng)作物豐產(chǎn)的主要因素之一。許多重大病害病原菌的頻繁變易。Crypt作為誘導植物SA R激發(fā)子。通過基因轉化的方法獲得了含有隱地蛋白基因以及其第13位點突變基因的綠色木霉工程菌，綠色木霉在作為隱地蛋白的傳達載體的同時，出現(xiàn)了誘導煙草抗病的功能。實驗研究的主要內(nèi)容包括以下幾個部分：1．構建了綠色木霉轉化的pCSNTCC和pCSNTCCm載體。為了能使綠色木霉合成的外源激發(fā)子蛋白分泌到培養(yǎng)液中，Crypt和其突變CrypK13VPCR定點突變，第13位氨基酸由賴氨酸‘K突變?yōu)槔i氨酸‘V基因前插入信號肽序列，引導外源激發(fā)子蛋白分泌到木霉細胞外，與寄主植物直接作用，誘導植物的防衛(wèi)反應。合成信號肽基因ThChi和目的基因Crypt和CrypK13V基礎上，以真菌表達載體pCSN43以及PBS載體為基本框架，經(jīng)過系列酶切、連接以及轉化等分子生物學技術，構建了crmt基因轉化綠色木霉的真菌表達載體PCSNTCC和0丁貝W3廠基因轉化綠色木霉真菌表達載體PCSNTCCm2．建立了綠色木霉的轉化體系。對綠色木霉原生質體制備和再生條件進行了較詳細的分析，并在此基礎上，利用限制酶介導進行了木霉原生質體轉化。結果標明，木霉原生質體形成的合適條件為：培養(yǎng)24h菌絲用4mg加LGlucanex磷酸鹽緩沖液中（pH6．9830C振蕩（40rmin酶解 4h原生質體產(chǎn)量達到4．7X10個加g原生質體在含 0．3molL肌醇和 0．3molLKCICM培養(yǎng)基上再生率為 14．5％。限制酶 ho介導轉化綠色木霉原生質體，其轉化率為每微克DNA 得到12個轉化子。轉化子的PCR鑒定以及特異酶聯(lián)免疫測定（ELISA we上ern雜交檢測標明，外源基因己轉入綠色木霉菌并在培養(yǎng)液中有穩(wěn)定的產(chǎn)物表達。30株原生質體再生株被確定為穩(wěn)定的轉化子，其中＊－1至＊－20為CryPt基因轉化子，TVZI至＊－30為o地們3V基因轉化子。3．轉化子誘導植物抗病性 轉化子的抗病分析結果標明，轉基因木霉菌株TV七和 TV六4等能夠分泌CryPt或CryK13V木霉動身株及轉基因木霉抱子處理煙草2個品種和十字花科植物擬南芥uthalfana根部 10d后，離體接種和植株整株接種病原菌，實驗標明轉化子能夠提高煙草對黑腔病菌（PhytOPhthomPrasftfcavarnlcotianad赤星病菌（Altemarfaaltata和煙草花葉病毒（TMV抗性，分子雜交檢測標明，轉化于能夠誘導煙草PR基因的表達。轉化于處置擬南芥，接種丁香假單胞菌和立枯絲核菌，離體接種和分子水平雜交均表明，擬南芥抗病性基本沒有得到提高，標明Crypt誘導抗病性具有一定的專化性。4．篩選轉化子TV3發(fā)酵培養(yǎng)基 轉化于TV3培養(yǎng)基篩選實驗標明，合適的利于工業(yè)化的固體生產(chǎn)RPA 培養(yǎng)基，組成配比為：40％稻草，5％豆餅粉，15％鼓皮，1．5％蔗糖，產(chǎn)抱量達到3．36X10cfumL液體MYG培養(yǎng)基，組成配比為麥芽汁30％，酵母提取物0．l％，葡萄糖1．5％，MgSO7Hzo0．l％，KHzPO0．1％，菌絲生物量達到6．74mgmL |
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