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		農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素

　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素，建立了穩(wěn)定、高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻的轉(zhuǎn)化體系。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將廣譜抗稻瘟病基因Pi9轉(zhuǎn)入8個(gè)秈稻品種(豐源B，湘晚秈11號，湘晚秈13號，R996，527，1701，25H003，25H075)和粳稻品種日本晴的愈傷組織中，得到了轉(zhuǎn)Pi9基因的株系，并對T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了GUS、PCR和RT-PCR檢測以及T2代植株的稻瘟病抗性鑒定。同時(shí)，對3個(gè)野生稻中的Pi2／9位點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)化分析。本研究主要結(jié)果如下：1 pc1301-Pi9質(zhì)粒的鑒定將大腸桿菌和農(nóng)桿菌中提取的質(zhì)粒pc1301-Pi9分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和KpnⅠ酶切，電泳分析表明質(zhì)粒pc1301-Pi9可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穩(wěn)定遺傳。2高效轉(zhuǎn)化體系的建立和Pi9基因?qū)Χi稻的轉(zhuǎn)化研究

　　不同培養(yǎng)基對秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響將8個(gè)秈稻品種的成熟種子分別接種子NB、N6、MS、CC和L3培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，NB、N6、MS、CC和L3這5種培養(yǎng)基誘導(dǎo)秈稻的平均出愈率分別為：81.7％、75.4％、68.0％、58.5％和55.5％。因此，NB培養(yǎng)基最適于誘導(dǎo)秈稻胚性愈傷組織。

　　ABA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響ABA對某些品種愈傷組織的誘導(dǎo)具改善作用，可減少褐化死亡現(xiàn)象。

　　愈傷組織的繼代分析比較了L3和NB兩種培養(yǎng)基對愈傷組織繼代效果，發(fā)現(xiàn)L3更適于愈傷組織繼代。愈傷組織繼代8d、15d、25d的分析表明，愈傷組織宜選擇繼代15d左右做共培養(yǎng)較好，這時(shí)愈傷組織大而嫩黃且生命力強(qiáng)。

　　共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響以1701為受體，共培養(yǎng)時(shí)間為1d、2d、3d、4d，獲得的抗性愈傷率分別為32.6％、68.2％、75.5％和60.0％。因此，共培養(yǎng)時(shí)間為3d的轉(zhuǎn)化效果最好，獲得的抗性愈傷率最高，達(dá)75.5％。(

　　不同菌液濃度對愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響用OD值為0.5、1.0、1.5、2.0的菌液濃度與1701的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得的抗性愈傷率分別為64.1％、74.7％、62.1％和51.0％。因此，OD值為1.0菌液濃度更適于秈稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化。

　　乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響共培養(yǎng)中加入200μmol／L的乙酰丁香酮可獲得的較高的抗性愈傷率，為75.3％。在菌液、共培養(yǎng)培養(yǎng)基以及同時(shí)在菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮，獲得1701的抗性愈傷率分別為59.8％、68.3％和75.7％。表明菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基同時(shí)加入乙酰丁香酮，轉(zhuǎn)化效果較好

　　篩選壓力的確定40mg／L的潮霉素B濃度適用于秈稻抗性愈傷組織的篩選；20mg／L的潮霉素B濃度用于生根培養(yǎng)基中幼苗的篩選.

　　抗性愈傷組織的篩選情況愈傷組織經(jīng)S_(40)培養(yǎng)基篩選后，日本晴的抗性愈傷率達(dá)89.9％。秈稻的抗性愈傷率在69.4％～82.5％之間，其中R996為69.4％，25H003為82.5％。

　　9個(gè)品種的轉(zhuǎn)化情況本研究日本晴的轉(zhuǎn)化率是63.3％，秈稻品種陽性苗的轉(zhuǎn)化率在3.2％～25.9％之間，其中25H075最低為3.2％，R996最高達(dá)25.9不同激素配比對愈傷組織分化率的影響6-BA 2mg／L+KT 2mg／L+NAA 0.5mg／L+IAA 0.5mg／L的激素配比適于抗性愈傷組織的分化。3 GUS、PCR和RT-PCR檢測及稻瘟病抗性鑒定對獲得的T1代和T2代植株經(jīng)GUS、PCR和RT-PCR檢測以及T2代植株的稻瘟病抗性鑒定，表明Pi9基因已整合到受體基因組中，并遺傳給子代，在子代中穩(wěn)定表達(dá)。4 Pi2／9位點(diǎn)的進(jìn)化分析對3個(gè)野生稻中的Pi2／9位點(diǎn)NBS-LRR基因與Pi2和Pi9位點(diǎn)NBS-LRR基因進(jìn)行序列比較分析，表明除假基因外的所有這些NBS-LRR基因?qū)儆谙嗤倪M(jìn)化樹，有共同的祖先，并且大多數(shù)NBS-LRR基因都有一個(gè)高度保守的內(nèi)含子。這一研究為稻瘟病抗性基因的進(jìn)化分析奠定了基礎(chǔ)，并為植物中廣譜抗性分子機(jī)理的闡明提供了線索。

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