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    光學(xué)技術(shù)圖像采集和數(shù)據(jù)處理的創(chuàng)新
          
      近期樣品處理,圖像采集和數(shù)據(jù)處理的創(chuàng)新,極大地提高幻燈片掃描和高通量篩選(HTS)應(yīng)用程序的自動顯微鏡成像系統(tǒng)的效用。盡管這樣的創(chuàng)新,在過去的50年中,這些系統(tǒng)中使用的光學(xué)設(shè)計變化不大。樣品通量和分析準(zhǔn)確度的顯著改善將導(dǎo)致結(jié)合成像光學(xué)元件是在一個水平可比其他系統(tǒng)組件的復(fù)雜。
      自動顯微鏡系統(tǒng)的數(shù)字化,分析和歸檔體外制劑可提高工作效率的病理學(xué)家通過刪除一些樣品成像負(fù)擔(dān)。商業(yè)系統(tǒng)的這種類型的數(shù)字化幻燈片,在高分辨率和存檔,以便以后檢查的結(jié)果。在藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中,高通量攝像系統(tǒng)獲得大量的圖像數(shù)據(jù),用于隨后的分析。需要每次獲取圖像,以確定最佳的焦點變成幻燈片的數(shù)字化和HTS系統(tǒng)吞吐量的主要限制因素。
      一種光學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的顯微鏡成像系統(tǒng)的深度增加也增加自動幻燈片放映和發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用程序的速度和效率。這種技術(shù),被稱為波前編碼(CDM Optics公司科羅拉多州博爾德),可以消除需要將重點集中在分析位置之間自動篩選和發(fā)現(xiàn)應(yīng)用。與使用傳統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)相比,波前編碼顯微鏡延伸的一個因素的10倍或更高,提高吞吐量,同時降低系統(tǒng)的復(fù)雜性和樣品制備的景深。
      波前編碼沒有演變出了傳統(tǒng)光學(xué)的境界,但應(yīng)用數(shù)學(xué)技術(shù)應(yīng)用于雷達(dá),光學(xué)應(yīng)用的結(jié)果。1波前編碼,成像負(fù)擔(dān)之間共享共同優(yōu)化的光學(xué)元件和信號處理算法。此組合的光學(xué)設(shè)計和信號處理提供了一種解決方案,多樣化的顯微鏡應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的問題的焦點。本文展示了如何擴(kuò)展深度成像福利兩個不同的應(yīng)用:明的巴氏涂片和熒光成像微量滴定分析。
      滑動掃描焦點問題雖然完整的歸檔一個典型的細(xì)胞學(xué)玻片制備要求收購數(shù)以百計的圖像,必須獲得更多的圖像,以確定最佳的焦點在每個位置的利益。所需的時間,移動樣品載物臺,等待階段沉降,并獲取圖像的滑動所需要的時間占70%以上的焦點。使用波前編碼擴(kuò)展深入成像的降低延遲和系統(tǒng)的復(fù)雜性與聚焦程序。
      對焦在幻燈片掃描應(yīng)用落在困難分為兩類:圖象內(nèi)interimage的。圖象內(nèi)misfocus的檢體的厚度時,會發(fā)生超過領(lǐng)域的成像系統(tǒng)的深度。由于許多商業(yè)制備方法旨在減少細(xì)胞中的分布深度,圖象內(nèi)misfocus通常只發(fā)生40倍或更大的放大倍率。
      Interimage misfocus結(jié)果從起伏的標(biāo)本幻燈片,傾斜樣品階段,或在幻燈片定位機(jī)制的變化提出了一個更重要的問題。盡管細(xì)胞的一種細(xì)胞學(xué)滑動制劑在小范圍內(nèi)的垂直分布可能是20倍的目標(biāo)字段的深度范圍內(nèi),從細(xì)胞的顯微鏡物鏡的距離可以改變超過30微米,而翻譯20000微米(2厘米)橫向樣本區(qū)。這種距離的變化超過了10X/0.25,20X/0.40目標(biāo),這是約8.5微米和5.8微米,深度的領(lǐng)域。為了彌補(bǔ)距離的目標(biāo)的這種變化,必須找到最佳的聚焦成像系統(tǒng)上的每個位置的滑動片。
      要說明的問題與misfocus,使用Zeiss Axioplan-2與20倍/ 0.50NA的物鏡(參見圖1)成像部的常規(guī)制備的巴氏涂片。手動設(shè)置使用計算機(jī)顯示器上查看圖像1B的第一個位置的焦點。樣品載物臺移動到左邊,1.5毫米,用于獲取圖像1a中,然后在右邊11毫米用于獲取圖像1c的。的焦點保持不變,在整個線性位移。
      在圖像1b,整個視野是在明確的重點。圖像1a是主要的焦點,但細(xì)胞層的厚度,由于在某些領(lǐng)域顯示圖象內(nèi)misfocus的。圖像1c為9.5毫米的圖像1b的權(quán)利,并且是在整個圖像的焦點。的的圖像間misfocus之間的圖像1b和1c的滑動的機(jī)械公差和階段機(jī)制的組合結(jié)果,并不能避免通過使用更薄的滑動制備方法。這個例子顯示了在每個成像位置在自動掃描應(yīng)用程序需要調(diào)整焦點。
      使用相同的20倍的目標(biāo),該成像序列,重復(fù)與波前編碼技術(shù)集成到顯微鏡。的焦點位置為第一個擴(kuò)展的深度圖像,1e中,再次被手動設(shè)置,觀察顯示器上的圖像。接下來的兩個圖像(1d和3420)均采取前相同的位置,保持不變的焦點。
      兩個圖像序列的比較表明,波前編碼顯微鏡延伸了景深,產(chǎn)生清晰的圖像,整個幻燈片。中圖像在圖像1C 1a和interimage misfocus的的圖象內(nèi)misfocus的都已經(jīng)被淘汰了。例如,細(xì)胞核中不可見的圖像1C 1811圖像清晰顯示了。隨著景深擴(kuò)展4倍,也可以減少了波前編碼圖像的整個滑動所需要的時間。
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