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		顯微鏡圖像恢復(fù)單色圖像的熒光細(xì)胞的細(xì)胞核

　　開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)，以盡量減少顯微鏡應(yīng)用的焦點(diǎn)問(wèn)題。這些技術(shù)包括激光掃描顯微鏡系統(tǒng)，復(fù)雜的，但耗費(fèi)時(shí)間重新調(diào)整程序，光學(xué)犧牲分辨率，景深越大，圖像去模糊或卷積算法。這些技術(shù)沒(méi)有減輕焦點(diǎn)問(wèn)題幻燈片掃描和篩選應(yīng)用需要的簡(jiǎn)單性和速度。

　　激光掃描共聚焦顯微鏡是一種強(qiáng)大的工具，構(gòu)建了一個(gè)三維圖像，所有圖像平面的標(biāo)本明確的重點(diǎn)。然而，在這些系統(tǒng)中，需要復(fù)雜的儀器，采集圖像，以分鐘為單位，而不是毫秒，一般僅限于熒光應(yīng)用。

　　熒光細(xì)胞分析，一系列在一個(gè)范圍內(nèi)的目標(biāo)的距離，拍攝的圖像，可以使用簡(jiǎn)單的算術(shù)投射到合成圖像的各像素的最大強(qiáng)度值重新組合。這個(gè)簡(jiǎn)單的重組患有低對(duì)比度由于雜散光，并要求在每個(gè)位置的多個(gè)圖像采集。更復(fù)雜的圖像去模糊的一系列圖像的去卷積算法已被廣泛的文獻(xiàn)報(bào)道。不足之處是，除了需要多個(gè)圖像采集，解卷積過(guò)程是迭代的，并可能采取從幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

　　一些市售的自動(dòng)成像系統(tǒng)使用專有模型，試圖預(yù)測(cè)集中在每個(gè)圖像位置。盡管這種類型的系統(tǒng)提供了一個(gè)更好的第一猜測(cè)正確的對(duì)焦距離，但它仍然是必要收購(gòu)幾個(gè)圖像確認(rèn)和微調(diào)的最佳焦點(diǎn)。2在大多數(shù)自動(dòng)化系統(tǒng)的主要限速步驟是時(shí)間需要階段和對(duì)焦系統(tǒng)被重新定位后定居。由于絕大多數(shù)的圖像被確定重點(diǎn)，使用波前編碼光學(xué)系統(tǒng)可以減少50-75％的采集時(shí)

　　波前編碼技術(shù)領(lǐng)域的顯微鏡的物鏡的深度延伸，并集成到成像系統(tǒng)的光學(xué)和信號(hào)處理路徑。在顯微鏡中，波前編碼的光纖可以直接到的微分干涉相差（DIC）的插槽中，沒(méi)有任何其他的光學(xué)系統(tǒng)的修改（參見(jiàn)圖2）。在信號(hào)處理路徑中，額外的線性濾波步驟恢復(fù)波前編碼的圖像領(lǐng)域的深度擴(kuò)展。

　　在傳統(tǒng)顯微鏡的光學(xué)元件，其主要功能是提供試樣重點(diǎn)鮮明的圖像的圖像檢測(cè)器。這要求減少在其他方面進(jìn)行了系統(tǒng)的靈活性。一種顯微鏡10X/0.25 40X/0.65目標(biāo)之間的切換時(shí)，可能會(huì)遇到在從8.5微米到1微米的景深減少。在傳統(tǒng)的顯微鏡，放大倍率越高，導(dǎo)致更高的分辨率，但只能在成本降低的景深。

　　深度擴(kuò)展使用波前編碼光學(xué)顯微鏡不同于傳統(tǒng)的顯微鏡在幾個(gè)關(guān)鍵方面。位于靠近背面的顯微鏡物鏡的孔徑，波前編碼光學(xué)元件的非球面光學(xué)元件的相位信息編碼到的圖像路徑。由于這種編碼，圖像直接形成在探測(cè)器的重點(diǎn)從來(lái)沒(méi)有達(dá)到良好的圖像出現(xiàn)模糊的眼睛。然而，模糊的圖像是一個(gè)獨(dú)特的功能，模糊焦距在大范圍內(nèi)是恒定的。這種模糊的圖像可以在一個(gè)較大的景深處理，以恢復(fù)大家關(guān)注的焦點(diǎn)，相比與傳統(tǒng)的顯微鏡圖像。

　　圖3。傳統(tǒng)的顯微鏡圖像在不同的聚焦位置（A-C）為0.5毫米的針孔。這些圖像被稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）。圖片D-f是中間PSF使用波前編碼顯微鏡圖像。圖片G-i的過(guò)濾PSF使用波前編碼顯微鏡圖像。

　　采取傳統(tǒng)和波前編碼光學(xué)圖像序列比較表明的原則的擴(kuò)展深入成像（見(jiàn)圖3）。針孔狀的物體的照片，稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF），是常用的顯微鏡系統(tǒng)的性能特征。PSF圖像揭示了如何客觀misfocuses作為一個(gè)對(duì)象從最佳聚焦點(diǎn)移開(kāi)。在圖3中，圖像-C顯示三個(gè)不同形象的一個(gè)40x/NA = 1.3油浸使用蔡司Axioscope的客觀觀察背光的0.5微米的針孔。

　　采取的最佳聚焦條件下，圖像3a示出了鋒利的，有限分辨率的圖像的背光針孔影像時(shí)，3b和3c是采取在增加量misfocus的針孔。作為的結(jié)果misfocus，3b和3c的圖像中的光被分散在大面積上，不再類似于原來(lái)的針孔對(duì)象的。聚焦的圖像的強(qiáng)度已經(jīng)歸一通過(guò)增加曝光misfocus。如果圖像3C圖像3A用相同的曝光，它會(huì)出現(xiàn)幾乎完全黑暗的。

　　圖片表明，D-F的Wavefront Coded目標(biāo)與點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)圖像A-C在外觀上有所不同。隨著波前編碼光學(xué)元件地方，最好的聚焦圖像（三維圖像）不再類似于相應(yīng)的傳統(tǒng)的最佳焦點(diǎn)PSF。波前編碼光學(xué)元件的形狀分布來(lái)自針孔為兩個(gè)正交的腿，從一個(gè)亮點(diǎn)發(fā)出的光的能量。

　　更重要的是，由于針孔的最佳聚焦位置移離，波前編碼的PSF顯著，因?yàn)樗鼪](méi)有在傳統(tǒng)的系統(tǒng)中不改變。圖片D-F顯示模糊波前編碼引入被稱為中間圖像。在中間距離的函數(shù)圖像的不變性是波前編碼成像的直接后果。

　　雖然PSF圖像?-F是不變的焦點(diǎn)在大范圍內(nèi)與傳統(tǒng)的圖像相比，這些中間圖像并不像原來(lái)的針孔對(duì)象。最后一個(gè)加工步驟必須應(yīng)用到中間的圖像恢復(fù)那些看起來(lái)像一個(gè)傳統(tǒng)的系統(tǒng)的最佳聚焦PSF。圖片G-i顯示處理后的Wavefront Coded圖像，這些圖像顯示清晰，即使在的最大misfocus，傳統(tǒng)PSF圖像嚴(yán)重的重點(diǎn)。重要的是要注意，信號(hào)處理應(yīng)用到的PSF是獨(dú)立的對(duì)象。同樣的算法恢復(fù)針孔成像的分辨率有限，以及它會(huì)恢復(fù)單色圖像的熒光細(xì)胞的細(xì)胞核，或彩色的明場(chǎng)圖像的子宮頸抹片檢查的準(zhǔn)備。

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