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| HTS熒光法應用波前編碼顯微鏡限制 | |||||||||||
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中間圖像的點擴展函數(shù)的misfocus在寬范圍內是不變的，相同的信號處理，可以應用到所有的中間圖像。該處理步驟包括一次性（非迭代）與中間圖像的數(shù)字濾波器的卷積。在Pentium III級計算機，它需要不到100毫秒的時間來處理1280×1024像素的中間圖像。有了這樣的加工時間短，波前編碼提供了另一種無法提供的圖像去模糊技術，使用512×512的圖像需要幾分鐘到幾小時完成迭代算法。
一個成像系統(tǒng)的校準過程，生成一個過濾器，用于與特定的光學配置的內核。在顯微鏡系統(tǒng)中，過濾器的內核是由光學系統(tǒng)的形狀，特定目標類型和放大倍率，中間繼電器倍率，和檢測器的像素間距。一旦與目標光學配置的成像系統(tǒng)被校準后，過濾器內核溶液可以被用于所有平臺上與此相同的結構。確定過濾器的內核開始收購多家PSF圖像，并將其提交到專有軟件，它落戶在一個過濾器的內核，讓最優(yōu)質的過濾圖像。
有幾種方法可以納入到圖像處理路徑的處理算法。CDM Optics公司（科羅拉多州博爾德）開發(fā)的動態(tài)鏈接庫，可以調用系統(tǒng)的控制軟件，適用于Windows 2000。濾波核的，也可以與圖像的卷積函數(shù)的MetaMorph分子設備公司（加利福尼亞州森尼韋爾），用于在IP實驗室由Scanalytics公司（維吉尼亞州Fairfax）格式化。處理算法也得到了實現(xiàn)數(shù)字化的硬件，使640×480像素每秒110幀的圖像處理。由于中間圖像被數(shù)字化后，立即截獲，波前編碼處理是透明的，最終用戶，接收聚焦圖像，并且可以進一步分析和歸檔。
HTS熒光法應用擴展聚焦與波前編碼光學系統(tǒng)的另一個特點是其適用于范圍廣泛的顯微鏡成像模式和應用程序，如明，暗場，熒光，霍夫曼調制對比度，DIC，和偏振成像方式。下面的示例演示，波前編碼顯微鏡的效用并不限于明場成像的組織和細胞的準備，但可以用來改善即使是最先進的熒光檢測。
發(fā)現(xiàn)在許多應用程序中使用的微量滴定板中提出misfocus滑動成像中所遇到的類似問題。將市售的塑料底的96孔微量培養(yǎng)板的高度而變化，從中心到邊緣超過3000微米，或單井一半的直徑為6毫米的水平位移井由多達30微米的。三張影像序列顯示1微米堅持底部的微孔板與的40X/0.6 ELWD目標和濱松光電奧卡2 CCD相機（見圖4）使用倒置顯微鏡的熒光珠，被送往附近的圖像4A井邊，重點手動設置。顯微鏡載物臺，然后在兩個步驟中的孔的中心與不調整焦點位置的情況下獲得的圖像在每個位置移向。畫像4b和4c顯示顯著的misfocus，導致亮度降低，作為光從胎圈著越來越大的區(qū)域被擴大。
重復該實驗，使用相同的光學配置，除了DIC插槽上的物鏡轉換器，波前編碼的光纖被插入。在影像D-F的Wavefront Coded處理圖像顯示很少或沒有misfocus。考慮如果需要HTS用戶打算在這三個位置執(zhí)行一個離散的細胞內檢測該微孔的數(shù)量的步驟。假設聚焦驗證，將需要至少四個在每個點的圖像，然后只有三個不同的位置所需要的15個步驟的采集和載物臺移動。波前編碼光學，只有第一聚焦步驟是必要的，需要七個步驟進行圖像采集和舞臺重新定位。
波前編碼光學系統(tǒng)提供的替代品的情況下，內或interimage misfocus限制的成像系統(tǒng)的吞吐量和效率。然而，某些成像應用程序不受益于擴展深度成像。有些圖像分析光學部分厚厚的標本，利用高解析度的目標領域的深度有限。根據(jù)客觀的數(shù)值孔徑，視場的深度可能是小至0.5微米，從而使非常薄的部分的可視化。在這種情況下，將不適合的Wavefront Coded光學對焦清晰，因為它帶來了整個標本量。
所有的圖像處理算法傾向于擴增現(xiàn)有的隨機的背景噪聲，波前編碼光學處理也不例外。但是，也有一些戰(zhàn)略擴展焦圖像中的噪聲放大最小化。隨機系統(tǒng)中的噪聲的主要來源是攝像機的電子噪聲。波前編碼光學器件，可適應幾乎所有市售的攝像頭，這樣的設備的選擇與適當?shù)母遱ignal-to-noise比不是一種限制。
此外，隨機噪聲的放大成比例增加的場的深度延伸。波前編碼的光纖配置決定的場深度的增加量，并應選擇提供了足夠的增加的特定應用程序。的景深。添加過量的擴展是可能避免的噪聲。
擴展深度與波前編碼光學成像提供了一種工具，以提高自動化顯微成像應用。雖然這種技術的光學系統(tǒng)和信號處理相結合的方式中，表示的基團出發(fā)，融入??自動化系統(tǒng)需要稍加修改的光學系統(tǒng)，只是增加了一個可管理的附加步驟的信號處理和數(shù)據(jù)分析管道。信號處理之后，可以進一步分析的擴展深度圖像存檔的相同的方式在傳統(tǒng)的顯微鏡系統(tǒng)。通過將波前編碼光學系統(tǒng)，通過消除或減少需要的樣品的數(shù)字化過程中的焦點調整，可實現(xiàn)顯著的時間節(jié)省。隨著越來越多的成像檢測技術變?yōu)榭捎?，波前編碼更大量的數(shù)據(jù)在相同或更少的時間時，與使用傳統(tǒng)的光學顯微鏡的系統(tǒng)相比，可用于采集。
參考文獻
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