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| 實驗裝置化學發(fā)光測定法實現(xiàn)的測量 | |||||||||||
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實驗裝置對PS-阿托工作試劑的制備以1:1的比例相結(jié)合，兩種解決方案。一系列10倍稀釋的辣根過氧化物酶的Biozyme實驗室國際有限公司（圣地亞哥）用水稀釋。發(fā)光從PS-阿托與HRP反應的時間過程，評估重復的100微升等分試樣的工作試劑反應3.5?10-16摩爾的HRP在25℃下 光照強度記錄在任何一個設(shè)計公司（桑尼維爾，CA）特納 TD 20E光度計提供一個中性密度濾光片，光強度或熱Labsystems（富蘭克林，MA）Luminoskan微孔板發(fā)光衰減。除非特別注明，所有的化學發(fā)光測量是在室溫下進行。
化學發(fā)光峰強度的關(guān)系的HRP量測定反應，一式三份PS-阿托和TMA-6分別與HRP溶液中制備的取值范圍為1.4的10μl的工作溶液的100微升等分試樣10-16日圓1.4?10-21摩爾。隨后光發(fā)電混合時，迅速達到最大強度。光強度的記錄，6分鐘混合后，在任何一個TD 20e的螢光光度計或Luminoskan 96 - 孔板的發(fā)光計。（本文中給出的強度測量，數(shù)字和表格是在相對光單位RLU）。
PS-阿托TMA-6存儲穩(wěn)定性超過1年的時間內(nèi)進行評估。工作溶液和單獨構(gòu)成的解決方案的樣品貯存于4℃，室溫和40℃下在棕色不透明的聚乙烯瓶中。等分被撤銷的時間間隔和分析的背景發(fā)光和發(fā)光峰值3.5?10-16摩爾HRP在25°C。百分比剩余活性測定比較，與對照樣品貯存于4℃。后者獨立沒有表現(xiàn)出改變的信號強度超過一年的存儲分離的組件解決方案。
表一HRP量使用PS-阿托化學發(fā)光檢測或TMA-6（點擊放大）發(fā)光強度的關(guān)系。甲測試抗原??，β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶標記抗體的Western blot分析進行使用硝酸纖維素膜和化學發(fā)光檢測TMA-6，5000的范圍內(nèi)，在與β-半乳糖苷酶的標準5皮克。短暫孵育印跡與試劑，排出過量的試劑，并在2小時的過程，潮濕的印跡與X射線膠片成像。
結(jié)果對PS-阿托檢測試劑由PS-阿托底物化合物（參見圖3a）中的緩沖溶液中含有酚性增強劑，過氧化氫，和其他專有組件以獲得最佳的分析性能。TMA-6類似的配方中含有過氧化物酶的底物化合物（參見圖3b）。
圖6。TSH酶聯(lián)免疫吸附試驗使用的的科瓦斯核心免疫檢測試劑盒（羅氏）的組成部分。發(fā)光檢測采用PS-阿托。二次抗體結(jié)合物稀釋2倍，以提高信號相對于背景。比色法數(shù)據(jù)來自包鑲（點擊放大）。
對PS-阿托基板與辣根過氧化物酶和過氧化氫的氧化作用被認為是產(chǎn)生二氧環(huán)乙烷中間體，隨后片段，以產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的吖啶酮（參見圖4）。反應所發(fā)射的光的跨越約400-550納米的區(qū)域中，與極大值，在430和445 nm。的頻譜匹配的熒光光譜N-benzylacridone的。TMA-6與HRP的氧化涉及到一個類似的機制，發(fā)射極為N-phenylacridone的。最大化學發(fā)光的PS-阿托幾乎是相同的。
PS-阿托或TMA-6試劑與HRP的反應混合后立即產(chǎn)生化學發(fā)光發(fā)射。最大強度達到幾秒鐘后，在室溫下和在反應過程中保持恒定強度的幾分鐘（參見圖5）。高原反應的HRP與PS-阿托化學發(fā)光強度呈線性關(guān)系的酶的量超過至少4個數(shù)量級，如示于表Ⅰ的曲線的斜率是由方程描述 Y = 0.931x + 18.689，R2 = 0.999。類似的動態(tài)范圍的HRP定量測定時的反應均在25℃和37℃下，使用PS-阿托。（數(shù)據(jù)未示出）測量的動態(tài)范圍TMA-6，并沒有延伸到盡可能低的水平，使用的條件下，與PS-阿托。
活性的PS-阿托工作后各個時期的存儲保持的解決方案，在4℃下或房間的溫度（a）中所占的百分比TMA-6工作溶液的活性的能力，后各個時期的存儲保持在4的容量百分比°C（B）?；顒颖硎拘迈r制備的組件單獨保存在4℃（點擊放大）對照樣品。極端的檢測靈敏度允許的發(fā)展高度敏感的酶免疫測定。與PS-阿托化學發(fā)光檢測ELISA試劑盒的cobas核心商業(yè)促甲狀腺激素（TSH）由羅氏（巴塞爾，瑞士），它采用比色法檢測抗體-HRP偶聯(lián)物，被修改。比色法報價0.05 MIU / L，檢測限為提供的最低標準是1 MIU / L。共軛雙重稀釋和PS-阿托代檢測試劑，化學發(fā)光檢測法適合。標準稀釋至0.003 MIU / L。
此化學發(fā)光測定法實現(xiàn)的測量，0.003廟/ L（見圖6）。的信號的最低的校準器，20.5±2.3 RLU，大大超過了空白10.2±2.3 RLU，所以計算出的檢出限的檢測實際上是有點低。此值不表示為了充分優(yōu)化的檢測，然而，測量化學發(fā)光綁定手動試管格式的在聚合物珠粒的表面的試劑時，分析的靈敏度受到不利的影響。
為了評估的試劑的穩(wěn)定性PS-阿托和TMA-6的工作解決方案，這些解決方案相結(jié)合，這兩個組件的50微升等分試樣和存儲的混合物在4℃下，并在室溫制備。3.5?10-16摩爾HRP化學發(fā)光檢測運行在25°C 這些測量是比獲得的值分別存儲在4℃下用新鮮制備的試劑從組件 結(jié)果顯示：在貯存試劑的性能沒有劣化，在室溫下?3周。PS-阿托不變，4個月后，在4℃，TMA-6和9個月后在該溫度下保持不變（參見圖7）。
在另外的實驗中，含有過氧化物酶底物的溶液成分在室溫下孵育，并在40℃下了數(shù)個月。結(jié)合的第二成分和上述測定得到的工作溶液的等分試樣。與使用新鮮配制的溶液，從組件分開存放在4℃下所獲得的結(jié)果進行了比較 沒有可檢測到的信號的變化，觀察到在工作解決方案，無論是從襯底制備試劑分開存儲長達5個月，在40℃下，在室溫下或1年。
與過氧化物酶結(jié)合的抗體和化學發(fā)光檢測TMA-6蛋白抗原的Western blot法檢測的β-半乳糖苷酶的抗原檢測系統(tǒng)進行?？乖磕繛?皮克5納克。物Lumigen PS-3和最敏感的商業(yè)魯米諾試劑ECL +硝酸纖維素膜（Amersham Biosciences公司，英國Amersham）進行了比較。TMA-6的檢測限低至或低于目前使用的最敏感的試劑。背景發(fā)光控制良好，足以讓低皮克數(shù)量的抗原檢測。所有的抗原的水平檢測到在從10分鐘至2小時的時間點（參見圖8）。
圖8。西方涂抹圖片TMA-6采用5秒曝光用化學發(fā)光法檢測β-半乳糖苷酶。印跡證明皮克靈敏度超過2小時的時間內(nèi)，A = 5000，B = 1000 PG，PG C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5皮克。描繪的時間點是：（一）第11分鐘，及（b）120分鐘（點擊放大）。
TMA-6工作解決方案的長期穩(wěn)定提供了進一步的措施，進行了超過1年期間通過串行Western印跡檢測。印跡協(xié)議的性能比較上述被描繪（見圖9），使用新鮮與1歲的TMA-6工作解決方案。結(jié)果表明減值印跡檢測靈敏度。
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