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		過氧化物酶和過氧化物酶結(jié)合物化學(xué)發(fā)光檢測

　　物L(fēng)umigen PS-阿托TMA-6是新的過氧化物酶和過氧化物酶結(jié)合物化學(xué)發(fā)光檢測試劑。每個這些試劑的試劑溶液制備按將兩種水溶液以1:1的比例相結(jié)合，并包含專有的基板，過氧化氫 ??，和增強(qiáng)子在緩沖溶液。的過氧化物酶與試劑的反應(yīng)非常迅速產(chǎn)生的峰值光強(qiáng)度。與目前使用的基于魯米諾試劑，這些積累基本上沒有涉及排放峰值時間。

　　高原強(qiáng)度的發(fā)展，在實驗中，光測量的精確定時是不必要的，用于確定光強(qiáng)度對酶量的依賴性。光的強(qiáng)度是足夠的，使檢測10-20摩爾的HRP在6分鐘的測定與PS-阿托和10-19摩爾TMA-6的兩倍以上使用極限的檢測標(biāo)準(zhǔn)的信號的空白空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差（見表I）。日志日志積光強(qiáng)度與HRP在實驗范圍內(nèi)10-16-10-20摩爾摩爾展出了高線性度。據(jù)預(yù)計，分析精度和動態(tài)范圍將得到改善，從更大數(shù)量的復(fù)制具有更寬的動態(tài)范圍的測量儀器上的數(shù)據(jù)加以收集。

　　圖9所示。圖像比較西方涂抹新鮮制備β-半乳糖苷酶檢測化學(xué)發(fā)光TMA-6工作解決方案（一）及（b）于4℃保存1年他們兩個有9分鐘的孵育膜在TMA-6和5秒的曝光后得到。（A = 5000，B = 1000 PG PG，C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5 PG）（點(diǎn)擊放大）。

　　雖然與TMA-6溶液中測定的過氧化物酶的檢測提供了幾乎相當(dāng)于實現(xiàn)了與PS-阿托的靈敏度和工作范圍，更高的絕對光強(qiáng)度與PS-阿托對于一個給定的酶量有所放大的非特異性結(jié)合的影響印跡膜。這可以有效果，在某些情況下限制印跡檢測的靈敏度。此外，TMA-6所產(chǎn)生的光的強(qiáng)度較低，允許使用較高的底物濃度在工作試劑。這反過來，最大限度地減少擴(kuò)展孵化或暴露在高層次的結(jié)合酶底物耗盡。

　　膜基印跡檢測的檢測試劑可靠的比較是非常困難的。如在下面更詳細(xì)討論的，印跡膜，特別是由X射線膠片上的光密度，定量測量是不精確的。推斷的檢測試劑的影響?yīng)氉詮倪@種類型的測量需要謹(jǐn)慎。另一個困難是抗體數(shù)量和靈敏度明顯的阻塞條件的影響。這些參數(shù)必須在印跡法憑經(jīng)驗優(yōu)化。哪些參數(shù)是最優(yōu)的出現(xiàn)依賴于檢測試劑的選擇，以及蛋白質(zhì)分析物和其他因素。任何打算檢測試劑進(jìn)行比較，然后，面對所有分析變量標(biāo)準(zhǔn)化，在這種情況下，一些測試將在非最佳條件下進(jìn)行，否則使用單獨(dú)優(yōu)化的條件下進(jìn)行技術(shù)上的不平等比較與選擇。

　　銘記這些注意事項，TMA-6，成立于ECL提前Amersham Biosciences公司W(wǎng)estern印跡檢測試劑盒，已經(jīng)比7兩個基于魯米諾試劑和試劑含有9,10 -二氫吖啶PS-3 Western blot檢測系統(tǒng)的性能。TMA-6檢測試劑所示，可提供優(yōu)越的背景信號，并檢測蛋白水平的降低比其他材料。每個試劑單獨(dú)優(yōu)化的實驗條件下使用。

　　過氧化物酶和結(jié)合物的高靈敏度地檢測的化學(xué)發(fā)光試劑的市售了好幾年。在使用中的大多數(shù)試劑構(gòu)成增強(qiáng)魯米諾的檢測系統(tǒng)。例子包括Amersham公司的ECL，從皮爾斯生物技術(shù)公司（Rockford，伊利諾州）超級信號，Lumiglo從嘉里建設(shè)有限公司（馬里蘭州蓋瑟斯堡），以及羅氏和鄰臨床診斷試劑。物L(fēng)umigen PS-1，唯一先前nonluminol的過氧化物酶檢測試劑使用的9,10 -二氫吖啶酯化合物作為過氧化物酶底物。所有這些試劑都由其制造商提供的，作為兩個獨(dú)立的部件，必須在即將使用前進(jìn)行組合，以創(chuàng)造一個有效的解決方案。這兩個工作溶液中過早反應(yīng)的底物與過氧化氫 ??的混合試劑中的底物的水解不穩(wěn)定性的問題，防止長期貯存溶液。

　　一些商業(yè)化學(xué)發(fā)光過氧化物酶底物的工作方案規(guī)定的有用壽命進(jìn)行了調(diào)查。他們發(fā)現(xiàn)范圍從“幾個小時”24小時在室溫下。更穩(wěn)定的工作試劑解決方案提供了簡化的自動化分析的優(yōu)勢。

　　對PS-阿托和TMA-6基板的設(shè)計的早期發(fā)現(xiàn)，的化學(xué)發(fā)光AP襯底物L(fēng)umigen APS-5也經(jīng)歷了化學(xué)發(fā)光的過氧化物酶與過氧化氫 ??的催化反應(yīng)（參見圖10）。反應(yīng)的APS-5與提示這兩種酶產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。環(huán)外雙鍵化合物與更大的水解穩(wěn)定性一個硫基結(jié)果，在更換的磷酸基團(tuán)。

　　在這種結(jié)構(gòu)類超過50種不同的候選化合物已準(zhǔn)備和測試。選擇兩種化合物用于商業(yè)開發(fā)解決方案的分析和固相分析TMA-6，PS-阿托，在結(jié)構(gòu)上非常相似，但有微妙的不同性能。令人滿意的水溶性的烷基磺酸取代基，每個分子中內(nèi)置憑借保留。朝向過氧化物酶的酶促活性被保留，為的是達(dá)到最大光強(qiáng)度的速度，。得顯著，未觀察到過氧化氫在襯底中的乙烯基硫醚基團(tuán)的非酶自氧化，即使在最后的工作溶液。

　　PS-阿托和TMA-6，評估通過監(jiān)視它們的任何變化后的存儲期間的化學(xué)發(fā)光峰值強(qiáng)度，工作溶液的試劑的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其它試劑在使用。只要為3個??星期，兩個試劑的工作溶液，在室溫下穩(wěn)定。解決方案可以在4℃下儲存，??并使用幾個月，如在圖7中示出。結(jié)果控制通過比較新鮮配制的工作液。含過氧化物酶底物的組分溶液表現(xiàn)出甚至更長的貯存穩(wěn)定性。沒有可檢測到5個月后，在40℃或1年??，在室溫下在溶液中測定的性能退化的發(fā)生。這種程度的水解穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過所有其他商業(yè)的化學(xué)發(fā)光過氧化物基板。

　　用于可視化固定化的酶標(biāo)記抗體的化學(xué)發(fā)光檢測試劑不一定必須符合相同的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的貯存穩(wěn)定性，例如，試劑在船上使用一個自動免疫分析儀必須。由于精度分析很少印跡技術(shù)正式評估，測量往往是最好看作是半定量。按鍵實驗變量是很難控制的抗體的質(zhì)量，膜性能，阻塞協(xié)議和綁定協(xié)議。此外，X射線膠片圖??像的光密度分析不能檢測在二維光強(qiáng)度圖案的細(xì)微的差別。（現(xiàn)代CCD相機(jī)成像系統(tǒng)，但是，改進(jìn)的能力有些印跡分析。）

　　由于這些原因的檢測試劑的質(zhì)量隨著時間的推移，微小的變化不會導(dǎo)致可測量的衰減印跡檢測性能。TMA-6存儲的質(zhì)量的評估工作溶液中的官能印跡測定形式，在結(jié)果沒有差異，得到即使在溶液中，使用可以在更嚴(yán)格的，儀器為基礎(chǔ)的解決方案測定中看出一些性能劣化。TMA-6存儲長達(dá)一年的工作方案，在4°C，使用前涂抹檢測的蛋白質(zhì)，從而是可以接受的做法。

　　結(jié)論P(yáng)S-阿托是第一化學(xué)發(fā)光的過氧化物酶底物，提供了能夠被存儲為一個瓶使用的試劑。在4℃下穩(wěn)定性的測試沒有發(fā)現(xiàn)存儲的工作溶液，在室溫下或4個月?3周的試劑的性能惡化此外，過氧化物酶底物本身是穩(wěn)定的，在室溫下了數(shù)個月。工作溶液的擴(kuò)展的貯存穩(wěn)定性允許一個單一的容器內(nèi)的試劑，可以采用過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光檢測。除了這種方便的明顯的好處，PS-阿托可以使用，而不需要額外的泵送和混合裝置將自動分析儀器。它能夠允許的極端敏感性過氧化物酶檢測定量過氧化物濃度超過四個日志，檢出限10 zmol在6分鐘檢測在保守估計。

　　TMA-6，印跡應(yīng)用中使用，如Western印跡法，開??發(fā)股份PS-阿托在快速信號的產(chǎn)生和試劑的穩(wěn)定性方面的優(yōu)點(diǎn)。它允許基于膜的印跡檢測的高靈敏度檢測。成像參數(shù)的優(yōu)化，以提供足夠的時間，信號的持續(xù)時間被延長的典型的印跡膜。

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　　哈希姆，博士，AKHAVAN Tafti的是副總裁兼首席科學(xué)官，謝文化，哲學(xué)博士，和雷努卡DeSilva酒店，博士，研究的科學(xué)家威廉·G·克里普斯和羅伯特A. Eickholt是研究化學(xué)家理查德·漢德利博士，主任知識產(chǎn)權(quán)朗達(dá)·林斯基和邁克爾·Mazelis是研究化學(xué)家A.保羅Schaap博士，物L(fēng)umigen公司（密西根州Southfield）的總裁。

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