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		直接和間接ELISA各種類型的ELISAs

　　ELISAs可以分為直接的和間接的方法。在一個直接ELISA,測定組件綁定到固體表面與酶標(biāo)記二分析組件。一般來說,直接ELISAs并不廣泛使用,作為標(biāo)記的抗原或抗體的主要耗時又昂貴。

　　在一個間接ELISA,檢測是進行一個酶標(biāo)記二次抗體。首先,一個初級抗體與抗原。在第二個孵化一步,一個標(biāo)記二次抗體能識別主要抗體是用。如果初級抗體來自同一物種被用在不同的化驗,相同的酶標(biāo)記二次抗體可以用于檢測。此外,靈敏度增加幾個二級抗體可以綁定到一個主要抗體,導(dǎo)致信號放大。各種各樣的標(biāo)記二次抗體是商業(yè)上可用。

　　三明治或捕獲ELISA。當(dāng)抗原不能被直接綁定到固體表面的分子,因為他們的屬性,一個三明治使用ELISA。固體表面上涂上一種特定抗體用于捕獲抗原。因此,一個三明治ELISA有時被稱為一個捕獲ELISA。在第二次免疫反應(yīng),另一種特定抗體是補充說,監(jiān)測到一個酶標(biāo)記二次抗體。因此,抗原抗體之間的綁定兩個。對于一個三明治ELISA、抗原必須包含至少兩個抗原,它允許并行綁定兩個抗體。

　　競爭性ELISA。如果分析物也太小了綁定兩個不同的抗體或如果只有一個特定的抗體可用,一個競爭ELISA可能是首選的分析格式。在一個競爭ELISA、標(biāo)記和預(yù)滴定測定組件添加同時與樣品。如果抗原被綁定到固體表面,然后混合樣品和添加標(biāo)記抗體在孵化的一步。包含在樣本的抗體和酶標(biāo)記抗體對抗原競爭結(jié)合。更包含在樣本的抗體,酶標(biāo)記抗體可用少與抗原涂層。減少的綁定標(biāo)記抗體的結(jié)果在一個下降的信號。另外,抗體可以綁定到表面,然后添加標(biāo)記抗原與抗原競爭包含在樣本在免疫反應(yīng)。

　　間接ELISA協(xié)議。下面的測試協(xié)議描述了一種間接ELISA在96孔聚苯乙烯高綁定微板塊,基于吸附綁定的胰島素的內(nèi)表面井和隨后的互動與一個特定的綁定胰島素單克隆抗胰島素抗體。檢測,一個反鼠標(biāo)IgG-HRP共軛是使用。

　　涂層。井充滿了100?l涂料解決方案(800 ng / ml的胰島素在0.05 M碳酸鹽緩沖;pH值9.6)和存儲在一個孵化器一夜之間(約18小時)在23°c。為了避免蒸發(fā),培養(yǎng)皿中都充滿了水,放在孵化器。另外,這些盤子可以密封與板密封材料。

　　洗滌。培養(yǎng)后,盤子都洗了四次350?l pbs t緩沖區(qū)(0.14 M氯化鈉;0.01警察丁;0.05%二層20;pH值7.4)/好。在最后一次洗滌步驟,液體完全被敲了板到紙毛巾。

　　阻塞。未綁定的網(wǎng)站被屏蔽在表面與BSA的結(jié)合,避免在后續(xù)測定步驟。抗體這些板塊都充滿了150?l /好阻止溶液(3% BSA在pbs t)和孵化60分鐘的23°c .培養(yǎng)后,解決方案是手傾析。剩下的液體被敲了板到紙毛巾。

　　添加主要抗體。在免疫化學(xué)反應(yīng)、抗胰島素抗體(初級抗體)添加和綁定的胰島素分子上。這些板塊都充滿了100?l /好初級抗體溶液(80 ng / ml單克隆抗胰島素抗體鼠標(biāo)在pbs t)和在23°C孵化為60分鐘。

　　洗滌。飄散的抗體被沖走在隨后的洗滌程序(重復(fù)洗滌步驟上面所描述的)。

　　增加二次抗體。之間的相互作用檢測胰島素和特定的抗體,抗小鼠IgG-HRP共軛(二次抗體)使用。這些板塊都充滿了100?l /良好的二次抗體溶液(300 ng / ml的抗小鼠免疫球蛋白g antibody-HRP共軛在pbs t)。這些板塊都在23°C孵化為60分鐘。

　　洗滌。重復(fù)洗滌步驟上面所描述的。

　　檢測。這些板塊都充滿了100?l /的襯底溶液(其中一部分3,3′,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)三個部分的檸檬酸/醋酸,每0.1米;pH值4.9)和在23°C的孵化20分鐘。TMB被HRP,和一個藍色的顏色被釋放。這個比色反應(yīng)是停止和固定通過添加100?l 0.5米硫酸/嗯,這改變了藍色的顏色黃色。強度的反應(yīng)和合成顏色是衡量一個微型板塊讀者在450海里。顏色是穩(wěn)定的最多一個小時,和板應(yīng)該在此時間段內(nèi)測量。

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